摘要 [目的]探讨豚草提取物对杨树烂皮病病原菌的抑制作用，为生物源农药的开发与利用提供理论依据。[方法]采用温浸-超声波连用提取法对豚草活性物质进行了提取，并研究了提取物对杨树烂皮病病原菌的抑制作用。[结果]不同浓度豚草提取物均对杨树烂皮病病原菌具有较强的抑制作用并呈线性增长趋势。[结论]豚草对真菌具有一定的抑制作用，且对生态环境及哺乳动物无害。
关键词 豚草;超声波;杨树烂皮病病原菌
中图分类号 S763.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）34-12111-02
Inhibition Effect of Crude Extracts of Ambrosia artemisiifolia L. against Cytospora chrysosperma
SUN Yan， ZHAO Hongying， SONG Xiaoshuang et al
（Heilongjiang Institute of Forest Protection，Harbin，Heilongjiang 150040）
Abstract [Objective] The aim was to understand inhibition effect of crude extracts of A. artemisiifolia L. against C. chrysosperma to provide theoretical basis for development and utilization of biopesticide. [Method] Crude extracts of A. artemisiifolia L. Were obtianed by the method of warm immersion with ultrasonic， and inhibition effect of the crude extracts against C. chrysosperma was studied. [Result] Different concentrations of the crude extracts had strong inhibition to the C. chrysosperma and took on linear growth. [Conclusion] A. artemisiifolia L. has certain inhibition to fungi， and is safe for eiroment and mamals.
Key words Ambrosia artemisiifolia L.; Ultrasonic; Cytospora chrysosperma （Pers） Fr.
豚草[1]（Ambrosia artemisiifolia L.），又称艾叶破布草、美洲艾，隶属于菊科豚草属，为1年生草本植物，高30～150 cm，直径2.5～5.0 mm。其生命力强，易于传播，种子可随作物、水流及交通工具携带进行传播。豚草原产于墨西哥北部的索诺兰沙漠地区和美国西南部，并在俄罗斯、美国、英国、日本等国家均有广泛分布。约于20世纪30年代传入我国东北地区，近几年随着国内外交流的日益增多，豚草的种子也随之传播到我国各地，并且迅速蔓延，并在华东、华中、华北、东北等至少15个省（区）都有发现，一些地区虽然已经大规模的拔除，但一些路边及河道仍有不少残余，且在不断蔓延。
豚草多生长于荒山空地、路边、沟旁、田块周围或农田中，可遮盖和压抑作物，阻碍农业操作，与作物争地争水，影响作物产量，吸入其花粉还可使人患上呼吸系统疾病，因此它是一种既影响人类健康又影响农牧业生产的危险性杂草，其繁殖快，危害大，为世界上公认的有害植物之一，并素有“植物杀手”之称，是国内外重点检疫对象。
杨树烂皮病[2][Cytospora chrysosperma（Pers.）Fr.]，又称溃疡病、腐烂病、臭皮病，病原为污黑腐皮壳（Valsa sordida Nit），属子囊菌纲球壳菌目间座壳菌科污浊腐皮壳属，通常以无性世代出现。杨树烂皮病是绿地、公园、行道树和苗圃杨树的常见病和多发病，经常引起行道树的大量枯死，新移栽的杨树发病尤为严重。该病在我国的杨树栽培区均有发生，但主要分布在东北、西北、华北等地。近几年，该病的发生量及发生程度呈上升趋势[3]。国外对豚草属植物研究结果表明，该属植物中含有丰富的倍半萜内酯类化合物，可尝试作为生物源农药进行研究[4]。为此，笔者利用温浸-超声波连用提取法对豚草的抑菌活性物质进行了提取，并研究了该提取物对杨树烂皮病病原菌的抑制作用及对小白鼠的安全性，旨在为豚草的生物源农药的开发与利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
供试植物。供试豚草采自黑龙江省牡丹江市。将新鲜的豚草清洗干净，先在通风处阴干，然后放入干燥箱中，50 ℃烘干至恒重，用分析型研磨机研磨粉碎，保存于棕色瓶中，备用。
1.1.2 供试菌种。供试杨树烂皮病菌种由发病杨树上分离鉴定得到。
1.2 方法
1.2.1 植物提取物母液的制备[5-6]。
取10 g豚草植物粉末，装入300 ml三角瓶中，加入80%乙醇250 ml，置于50 ℃恒温水浴锅中温浸3 h，取出后放到超声波提取器中振荡40 min，然后再置于50 ℃恒温水浴锅中温浸3 h，最后将浸好的药液用真空泵反复减压抽滤，得到澄清的乙醇粗提液。将乙醇粗提液在40 ℃下用旋转蒸发仪进行减压浓缩至原液呈现出浓油状为止，用10%聚山梨酯80作为溶媒进行溶解定容至50 ml（即质量浓度为200 mg/ml），物理灭菌后放入4 ℃冰箱保存，备用。
1.2.2 豚草提取物抑菌活性测定方法。
1.2.2.1 PDA培养基的制备。
将洗净去皮的马铃薯200 g切碎，加1 000 ml水煮沸30 min，然后用纱布过滤去除马铃薯，再加水定容至1 000 ml，加入18 g琼脂和20 g蔗糖，加热至琼脂完全溶化，趁热用纱布过滤并分装于三角瓶中，在121 ℃下加压蒸汽灭菌20 min后备用。
1.2.2.2 带毒平板培养基的制备。
将豚草粗提液母液稀释成0.25、1.00、4.00、20.00、40.00和80.00 mg/ml系列浓度梯度，分别量取一定量各浓度药液加入到热培养基中，混合均匀后倒入培养皿内，冷凝后即成为带活性物质的培养基。
1.2.2.3 生长速率法测定抑菌率[7]。
用“1.2.2.2”制备的不同浓度含药培养基培养病原菌，以病原菌菌丝的生长速率快慢判定不同样品抑制效果的强弱。
用灭菌后的直径为5 mm的打孔器在培养好的菌落外缘切下带菌培养基菌饼。用酒精灯火焰灭菌后的接种针或消毒的镊子将菌饼放置在带毒培养基和对照培养基上，菌丝面向下，每皿接1块，置于26 ℃恒温培养箱中培养。每隔24 h观察一次，用十字交叉法测量菌落直径2次，取平均值，计算菌丝生长抑制率。
菌落生长直径（mm）=2次直径平均值-5.0（菌饼直径）
抑制率=（对照净生长直径-处理生长直径）/对照净生长直径
1.2.3 豚草粗提物的安全性试验。
选用体重在17～22 g的健康小白鼠，性别相同或雌雄各半。通过胃肠给药的方式进行安全性试验。
豚草提取物设5个剂量组，分别为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 ml，分组灌服不同剂量的受试小白鼠。为能得到理想的结果，试验从中间剂量开始，以便从最初几个剂量组动物接受药物后的反应来判断两端剂量是否合适，便于调整剂量和组数。为了提高试验的精确度和节省药物，受试药物按“低比稀释法”配制。给药后逐日观察并记录小白鼠中毒反应、死亡率和死亡情况。
2 结果与分析
2.1 豚草提取物对杨树烂皮病病原菌菌丝生长的抑制作用
由图1可知，不同浓度的豚草提取物均在48 h后对杨树烂皮病病原菌产生较强的抑制作用，并呈缓慢增长趋势。0.25 mg/ml豚草提取物对杨树烂皮病菌的平均抑菌率为45.67%，1.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率为51.22%，4.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率为53.92%，20.00 mg/ml豚草提取物平均抑菌率为60.57%，40.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率为66.37%，80.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率为85.13%。可见，当豚草提取物浓度达到1.00 mg/ml以上时，抑菌率均达到50%以上，当豚草提取物浓度达到80.00 mg/ml时，抑菌率达到85%以上。
图1 不同浓度豚草提取物对杨树烂皮病菌的抑制作用
2.2 豚草提取物对杨树烂皮病病原菌抑制中浓度（EC50）的确定
由图2可知，不同浓度豚草提取物对杨树烂皮病菌的抑制作用呈线性增长趋势，浓度越高，豚草提取物对杨树烂皮病菌的抑制作用越大，其线性回归方程为：y=0.442 8x+49.76，R2=0.970 3，相关性良好，由此得出豚草提取物对杨树烂皮病病原菌菌丝的EC50为542.005 mg/L。
图2 豚草提取物对杨树烂皮病菌的抑制作用线性关系
2.3 豚草粗提物对小白鼠的致死中量（LD50）的确定
采用改进寇氏法，得出豚草粗提液对小白鼠的LD50为7 466.299 mg/kg 。由图3可知，豚草粗提物浓度对数与校正死亡率机率值成线性相关，其线性方程为：y=5.889 2x-17.809，R2=0.937 6，相关性良好。
图3 豚草粗提液毒力测定线性关系
冀农[8]根据农药LD50的多少可将农药的毒性分为以下5级：
剧毒农药，LD50为1～50 mg/kg（体重）;
高毒农药，LD50为51～100 mg/kg（体重）;
中毒农药，LD50为101～500 mg/kg（体重）;
低毒农药，LD50为501～5 000 mg/kg（体重）;
微毒农药，LD50为5 000 mg/kg（体重）以上。
根据该农药毒性等级划分标准，豚草粗提物的LD50大于5 000 mg/kg，为微毒，对生态环境及哺乳动物无害，可作为植物源农药进行开发。
3 结论
豚草作为入侵植物，近些年来对其治理的研究报道较多，而对于其开发和利用的研究极少，该研究试图挖掘其可利用价值，使其变废为宝，以达到以用为治的目的。
植物有效成分的提取多采用单一方法，提取率较低，该研究尝试运用2种方法相结合的方式来提取豚草的抑菌粗提物，并研究其对杨树烂皮病病原菌菌丝的抑制作用。
将浸渍法与超声波技术相接合的技术应用于豚草活性物质的提取，不仅可保持有效成分的活性，同时可节省时间，简化提取纯化流程，提高提取效率，且该方法易于推广。豚草的80%乙醇浸渍-超声波连用技术的提取物对杨树烂皮病原菌的抑制试验结果表明，豚草提取物对杨树烂皮病病原菌有较强的抑制作用，当质量浓度在80.00 mg/ml时，抑菌率达到85%以上，且提取物的浓度与抑制作用呈正相关，其抑制率呈线性增长趋势，依据农药毒性等级，该提取物为微毒。由
此得出，豚草对真菌具有一定的抑制作用，且对生态环境及