辅以多粘类芽孢杆菌堆肥提取液工艺及其对土壤微生物群落结构的影响


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摘要:以猪粪堆肥为原料,建立多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)与猪粪堆肥提取液的配伍技术工艺,并研究其对烟草黑胫病(Phytophthora parasitica)土壤微生物群落结构的影响。结果表明,最佳技术工艺是多粘类芽孢杆菌添加到猪粪堆肥中发酵72 h,再按照水∶堆肥8∶1(质量比)浸提48 h。不同工艺提取的猪粪堆肥提取液均能有效抑制烟草黑胫病病原菌的生长。与对照相比,施用辅以多粘类芽孢杆菌的堆肥提取液处理土壤疫霉ITS基因拷贝数减少了18.15%~53.33%,土壤中芽孢杆菌数量增加了45.63%~255.00%,同时增加了土壤细菌和放线菌数量,但是减少了真菌数量。辅以多粘类芽孢杆菌的猪粪堆肥提取液处理增加了Bacillus niabensis和B. aryabhttai的丰富度和细菌遗传多样性,但降低了真菌的丰富度和遗传多样性。

关键词:多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa);堆肥提取液;浸提工艺;遗传多样性

中图分类号:Q938.1 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2017)04-0634-06

堆肥提取液是一个丰富的微生物资源库,含有大量的各种微生物,具有潜在的促生及生防作用[1]。堆肥提取液的生防效果与堆肥提取液中微生物的数量有关[2-4]。在堆肥提取液中添加拮抗微生物能够增强作物抗性,以水稻秸秆为原料的堆肥提取液经木霉(Trichoderma harzianum)加强后可使得黄秋葵湿腐病(Choanephora cucurbitarum)的发生率减少85%[5]。在土壤中浇灌好气提取堆肥提取液和添加拮抗菌的好气提取堆肥提取液,可使马铃薯茎溃疡病(Rhizoctonia solani Kühn)和疮痂病减少到18%~33%[6]。堆肥提取液过滤除菌或加热灭菌后仍还有抑菌作用[7],说明堆肥提取液的生防效果与微生物产生的抗生物质有关。在堆肥提取液中辅以兼具促生及生防的根际有益微生物将成为未来堆肥提取液生防研究的热点内容之一[8]。但是如何将有益微生物与堆肥提取液进行配伍,以最大程度发挥有益微生物和堆肥提取液的生防促生效果,还有待于进一步的研究。

近年来,越来越多的学者提出从根际微生态角度综合研究解决土传病害的新思路[9],并认为根际微生态失调可能是土传病害发生的主要原因[10]。由于烟草根际微生态是烟草-土壤-微生物及其环境相互作用的特殊系统,因此,协调三者关系应该是解决烟草黑胫病连作障碍的关键问题。芽孢杆菌被认为是土壤微生物中最具活力的部分之一,也是土壤细菌中的优势种群,在土壤的物质和能量循环中发挥重要作用,尤其是作为生物菌剂在生物防控和促进植物生长方面有着重要的应用价值[11]。随着对土传病害发生土壤核心或关键微生物种群研究的深入,发现芽孢杆菌在降低土传真菌病害发生和调控病害发生的根际土壤微生物区系方面发挥着重要作用[9]。因此,在烟草黑胫病的生物防控上,应坚持减少土壤中黑胫病病原菌的数量和调控烟草黑胫病病害发生的根际土壤微生态群落结构多样性并重的原则。

多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)属于芽孢杆菌属,有关其强化的堆肥提取液对植烟土壤微生物群落结构的影响等方面的研究尚不多见。因此,本研究以腐熟的猪粪堆肥为原料,建立多粘芽孢杆菌与猪粪堆肥提取液的配伍技术工艺,并研究其对烟草黑胫病土壤微生物群落结构的影响,以期为堆肥提取液的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

猪粪堆肥由鄂州市广丰有机肥有限公司提供,有机质39.55%,全氮2.59%,全磷7.94%和全钾1.37%。芽孢杆菌为湖北省农业科学院植保土肥研究所实验室筛选的多粘类芽孢杆菌ZWYY-5。烤烟品种为云烟87。供试土壤为连续种植烟草且黑胫病严重发生,土壤基本理化性质为pH 6.65,有机质17.50 g/kg,碱解氮108.30 g/kg,速效磷33.88 g/kg,速效钾149.76 g/kg。

1.2 试验设计

1.2.1 辅以多粘芽孢杆菌的堆肥提取液工艺 工艺1:选用NB培养基,培养多粘类芽孢杆菌48 h后计数,离心浓缩至数量达到108~109 CFU/mL,定容到200 mL。将200 mL菌液加到1 kg堆肥中,并调节水分含量,分别发酵24、36、48、72、96 h,于4 ℃保存。将25 g发酵好的上述堆肥(發酵不同天数)加入到500 mL容量瓶中,再加入200 mL自来水,即水∶堆肥8∶1(质量比),浸提48 h,浸提完成后分别经双层纱布过滤,于4 ℃保存。

工艺2:将25 g堆肥加入到500 mL容量瓶中,再加入200 mL自来水,浸提48 h,浸提完成后分别经双层纱布过滤,4 ℃保存。选用NB培养基,培养多粘类芽孢杆菌48 h后计数,离心浓缩至拮抗菌数量达到108~109,定容到200 mL。吸取拮抗菌菌液20 mL,加入到180 mL的堆肥提取液中,分别浸提12、24、36、48、60、72 h,于4 ℃保存。

1.2.2 盆栽试验 于2014年湖北省农业科学院植保土肥研究所温室中进行。试验设置4个处理,①清水对照(CK);②多粘类芽孢杆菌菌悬液(B);③猪粪堆肥提取液(CT);④辅以多粘类芽孢杆菌的猪粪堆肥提取液(B+CT)。每盆装有1 kg烟草黑胫病连作土,每处理重复10次。每盆加10 g复合肥(10-10-20)与土壤混匀。土壤中病原菌数量达到3.45×104 CFU/g干土。当烟苗两叶一心时移栽,常规水分管理。移栽时每盆浇灌100 mL菌液、堆肥提取液和辅以多粘类芽孢杆菌的堆肥提取液,此后每隔7 d浇灌一次,试验持续45 d。分别于15、30、45 d采集根际土壤样品。

1.3 测定方法

微生物区系采用连续稀释培养法,细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基,放线菌采用高氏1号培养基,真菌采用马丁氏培养基。烟草黑胫病病原菌疫霉的荧光定量方法参考潘明森等[12]方法。芽孢杆菌则采用LB培养基,涂布前将稀释液于80 ℃水浴15 min。将每克干土形成的菌落数(CFU)取对数值,以lg(CFU/g干土)表示。

土壤DNA提取采用土壤基因组DNA提取试剂盒(MP bio公司)。PCR扩增采用16S rDNA引物Eub338:5′-GC clamp-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG

-3′,Eub518:5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′,其中,GC clamp为5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGC

CCGCCGC-CCCCGCCCC-3′。PCR扩增参考钟书堂等[13]方法。电泳结束后银染胶片并扫描保存,分析DGGE胶片上消失与增加条带及一些共有条带的强度差异,切割回收特异条带并测序。

1.4 数据处理

DGGE电泳图谱采用Quantity One 4.4.0软件进行条带检测和强度分析。非加权组平均法(UPGMA)进行集群分析。丰度即为DGGE条带数。Shannon多样性指数(H)计算公式为:

H=-∑PilnPi,式中,Pi=Ni/N。Pi为特异性个体群落数占总群落数的比例,Ni为个体条带强度,N为测出的所有条带强度总和。数据统计分析使用Excel 2003和SPSS 13.0软件,通过Duncan法检验处理间差异的显著性水平。

2 结果与分析

2.1 辅以多粘类芽孢杆菌堆肥提取液的工艺研究

由表1可知,随着堆置时间的延长,提取液中细菌、芽孢杆菌和放线菌数量均呈现出先增加后减少的变化趋势。对于细菌而言,堆置72 h处理分别比堆置24、36、48、96 h细菌增加了2.03倍、92.10%、43.53%和1.42倍,且差异达到显著水平(P<0.05)。堆置72 h处理芽孢杆菌数量分别比堆置24、36、48、96 h增加了1.19倍、51.19%、29.66%和23.63%。堆置72 h处理放线菌数量分别比堆置24、36、48、96 h增加了69.46%、60.56%、35.57%和35.57%。堆置72 h处理真菌数量分别比堆置24、36、48、96 h减少了21.79%、24.63%、26.75%和20.61%,但处理間差异不显著。

由表2可知,浸提24 h堆肥提取液中细菌数量最低,分别比浸提12、36、48、60、72 h减少了26.48%、18.14%、14.21%、11.70%和42.29%。对于芽孢杆菌数量而言,浸提48 h最高,分别比12、24、36、60、72 h增加了1.99、1.22倍、55.12%、36.96%和52.63%,且差异达到显著水平(P<0.05)。浸提60 h堆肥提取液中放线菌数量最高,分别比12、24、36、48、72 h增加了45.95%、16.56%、22.73%、11.73%和43.35%,但处理间差异不显著。对于真菌数量而言,浸提48 h最高,分别比12、24、36、60、72 h增加了47.33%、13.01%、0.60%、24.07%和19.57%。

由表3可知,随着堆置时间的延长,添加堆肥提取液后,黑胫病病原菌的菌落直径都为0,抑制效果均为100%。但未添加多粘类芽孢杆菌的堆肥提取液,经过过滤除菌后丧失了抑菌效果。同样,先在堆肥中添加多粘类芽孢杆菌后浸提,浸提时间的长短对于抑菌效果亦无影响。

2.2 辅以多粘类芽孢杆菌堆肥提取液对土壤微生物区系的影响

图1a表示不同处理对土壤黑胫病病原菌ITS基因拷贝数的影响。由图1a可知,移栽后15 d,B、CT和B+CT处理黑胫病病原菌ITS拷贝数分别比CK减少了10.98%、19.51%和33.33%,但处理间差异不显著;然而移栽后30 d,B、CT和B+CT处理黑胫病病原菌ITS拷贝数分别比CK减少了12.28%、14.21%和18.15%,处理与CK之间差异达到显著水平(P<0.05);移栽后45 d,B、CT和B+CT处理黑胫病病原菌ITS拷贝数分别比CK减少了30.00%、41.67%和53.33%,且B+CT与CK处理间差异达到显著水平(P<0.05)。

图1b表示不同处理对土壤芽孢杆菌数量的影响。由图1b可知,移栽后15 d,B、CT和B+CT处理芽孢杆菌数量分别比CK增加了8.13%、1.88%和45.63%,但处理间差异不显著。在移栽后30 d,B、CT和B+CT处理芽孢杆菌数量分别比CK增加了1.99、1.61、2.36倍,各处理与CK之间、CT与B+CT处理之间差异达到显著水平(P<0.05)。在移栽后45 d,B、CT和B+CT处理芽孢杆菌数量分别比CK增加了32.26%、53.76%和2.55倍,且B+CT处理与CK及B、CT处理间差异达到显著水平(P<0.05)。

由表4可知,在移栽后15 d,B、CT和B+CT处理细菌数量分别比CK增加了20.66%、29.57%和52.96%,而在30 d和45 d,B、CT、B+CT处理细菌数量分别比CK增加了23.18%和2.44%、28.75%和68.50%、69.99%和1.14倍,且CK与B+CT处理间差异均达到显著水平(P<0.05)。对于放线菌而言,CT和B+CT处理移栽后15 d放线菌数量分别比CK增加了3.52%和8.03%。而在30 d和45 d,B、CT、B+CT处理放线菌数量分别比CK增加了6.15%和3.47%、7.23%和18.90%、13.98%和69.05%,且CK与B+CT处理间差异达到显著水平(P<0.05)。对于真菌数量而言,在移栽后15 d,B、CT和B+CT处理分别比CK减少了9.96%、7.88%和12.14%,B、CT、B+CT处理移栽后30 d和45 d分别比CK减少了20.59%和9.56%、13.52%和6.98%、37.06%和12.57%,且CK与B+CT处理间差异达到显著水平(P<0.05)。

2.3 辅以多粘类芽孢杆菌堆肥提取液对土壤微生物群落结构的影响

由图2可知,不同处理间细菌DGGE条带差异较小(图2A),而真菌条带略有差异(图2B)。对于细菌丰富度而言(表5),B+CT处理最高,分别比CK、B和CT处理增加了1、1和2,且与CT处理间差异达到显著水平。B+CT处理Shannon指数分别比CK、B和CT处理增加了0.06、0.05和0.04;对于真菌丰富度而言,B+CT处理分别比CK、CT处理减少了1和3,但比B处理增加了5,且不同处理间差异达到显著水平。CT处理Shannon指数分别比CK、B和B+CT处理增加了0.09、0.27和0.12。

细菌条带切胶测序结果(表6)表明,可能的细菌属为芽孢杆菌属、链霉菌属、黄杆菌属、黄色单胞菌属和草酸杆菌属,分别属于厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和变形菌门。

真菌条带切胶测序结果(表7)表明,可能的真菌属为曲霉属、地丝霉属、粪盘菌属、支顶孢属、镰刀菌属、甘蓝菌属和大环柄菇属,且主要归属于子囊菌门和担子菌门。

3 小结与讨论

3.1 不同提取工艺堆肥提取液微生物数量及其对病原菌的抑制效果

影响堆肥提取液生防和促生效果的因素包括堆肥生产过程中的影响因素(原料种类、腐熟时间等)、提取过程的影响因素(堆肥与提取液的提取比例、提取过程中是否通气或搅拌、提取时间、提取温度、pH等)以及添加的营养物质种类和数量等[1,3,8,14]。研究发现,堆肥提取液的防控效果与堆肥提取液中微生物的数量呈正相关[2,3];也有研究表明堆肥提取液过滤除菌或加热灭菌后仍保留抑菌作用[7],这可能是由于抗生物质的存在所致。基于此,一些研究者对在堆肥提取液中添加外源功能微生物方面进行了试验[15,16]。在本试验中,不论工艺1还是工艺2,浸提72 h的堆肥提取液细菌总数和芽孢杆菌总数均最高,但是工艺1细菌和芽孢杆菌的总数要高于工艺2,这也进一步说明了堆肥原料和工艺对堆肥提取液中微生物数量的影响[4,14,15]。但对于其防治效果而言,两种工艺制作的堆肥提取液均能完全抑制平板上黑胫病病原菌的生长,而是否添加多粘类芽孢杆菌对堆肥提取液的抑菌效果没有影响,这说明堆肥提取液中土著微生物的数量足以抑制病原菌的生长,这与前期的研究结果一致[1,2]。

3.2 辅以多粘类芽孢杆菌堆肥提取液对黑胫病发生的土壤群落结构的影响

研究表明,与堆肥提取液相比,经过生防菌强化的堆肥提取液具有较高的防病效果[15,17,18]。在本试验中,与堆肥提取液相比,经過多粘类芽孢杆菌强化的堆肥提取液处理土壤中疫霉菌ITS拷贝数显著降低,这可能与土壤中芽孢杆菌对疫霉菌的拮抗作用有关。与对照相比,施用堆肥提取液、菌剂以及辅以芽孢杆菌的堆肥提取液均能增加土壤细菌和放线菌总数,但是减少了真菌的数量。由于堆肥或者堆肥提取液本身就是一个微生物资源库,添加到土壤中势必会增加土壤中的微生物数量[4]。大量的研究表明,将拮抗菌添加到有机肥中制成生物有机肥,再施用到土壤中不仅能够增加细菌数量,还能增加土壤微生物群落结构多样性[19,20]。

平板计数方法仅能反映土壤中可培养微生物种群的数量变化,无法反映微生物种类的改变。PCR-DGGE被应用于研究可培养细菌群落的变化并探寻影响细菌群落变化的生物和环境关键因子[21]。通过PCR-DGGE分析发现,施用辅以多粘类芽孢杆菌的堆肥提取液增加了土壤细菌丰富度和遗传多样性指数。付琳等[22]的DGGE结果表明,施用生物有机肥的香蕉园土壤总细菌的丰富度及多样性明显提高。虽然两者施用的有机肥状态(液体和固体)不同,但两者的结果相似。细菌DGGE部分条带切胶回收测序分析表明,4种处理土壤中细菌主要以厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和变形菌门为主,不同处理间种类差异较小,但是辅以多粘类芽孢杆菌的猪粪堆肥提取液有增加土壤中Bacillus niabensis和B. aryabhttai丰富度的趋势。真菌DGGE部分条带切胶回收测序分析表明,单施菌剂减少了曲霉属、粪盘菌属、支顶孢属、镰刀菌属、甘蓝菌属和大环柄菇属的丰富度。此外,在CK和CT处理中均发现有镰刀菌属菌种存在,但是在B和B+CT处理中则不存在,这可能是由于多粘类芽孢杆菌能够产生多种拮抗物质并能抑制尖孢镰刀菌的生长所致[13]。施用菌剂和堆肥提取液减少了曲霉属和新缝匠菌的丰富度。

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