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摘要：[目的]分离、鉴定广西南宁葡萄园中引发巨峰葡萄果实溢糖性霉斑的病原菌，为该病的防治提供参考依据。[方法]采用5点采样法在发病葡萄园区进行溢糖性霉斑发病情况调查和症状观察；随机选择100个具有典型形态特征的单一霉斑，挑取病原菌孢子进行菌株分离和纯化培养，根据柯赫氏法则分别验证其形成霉斑的致病力，并通过形态学观察及分子生物学手段对病原菌进行鉴定。[结果]被调查葡萄园中，2015年冬季果、2016年夏季和冬季果的葡萄果实溢糖性霉斑发病率分别达86.00%、87.32%和89.33%，发病指数分别为52.80、62.40和58.27。从100个霉斑样本中分离获得的优势菌株均具有相似的菌落形态，随机选取其中8株菌株进行验证，结果发现8株菌株均具有形成霉斑的致病力。根据形态学特征和分子生物学鉴定结果，确认分离所得的病原菌为橘青霉（Penicilliumcitrinum）。[结论]橘青霉（P. citrinum）是引起广西南宁巨峰葡萄果实溢糖性霉斑的病原菌之一，当前应从栽培技术人手做好综合防控工作。
关键词：葡萄；果实溢糖性霉斑；橘青霉；真菌病害；广西南宁
中图分类号：S432.42 文献标志码：A 文章编号：2095—1191（2018）03-0495-06
0引言
[研究意义]自2003年以来，广西农业科学院在南方葡萄一年两收栽培研究方面取得突破（白先进等，2008；尹玲等，2017），促使广西葡萄栽培产业迅速发展，但气候因素使得广西葡萄栽培过程中病害频发，如何有效防控病害成为广西葡萄产业健康发展的关键性问题之一（李顺辉等，2012；林玲等，2016）。自2011年以来，本研究团队在广西中部和南部多个葡萄园区发现一种新病害，该病在果实接近成熟时发病，病果果皮表面布满雪花状霉斑，虽然果实发病后并无进一步溃烂或落粒等现象，但因外观品质严重受损，使病果丧失商品价值。目前尚未有关于该现象的系统研究报道，业内习惯性的将该现象称为葡萄果实溢糖性霉斑，该新型病害已对广西葡萄产业构成巨大威胁，急需对其开展系统研究，而确定该病的病原菌更是首要问题。[前人研究进展]关于葡萄微生物病害的病原鉴定工作一直是葡萄学科的研究热点，炭疽病、穗轴褐枯病、酸腐病等主要葡萄果实微生物病害的病原菌鉴定已有较多报道。邓维萍等（2013）利用形态鉴定与特异性引物分子检测相结合的方法对从云南省主要葡萄产区采集的60株炭疽病菌菌株进行鉴定，结果表明，引起云南葡萄主产区炭疽病的病原为胶孢炭疽菌；供试胶孢炭疽菌对红提葡萄均有致病力，但菌株致病力差异明显，对番茄和草莓存在交叉侵染能力，且对多菌灵的敏感性较尖孢炭疽菌高。Pisani等（2015）研究发现，黑曲霉和碳黑曲霉在引发葡萄酸腐病的过程中会形成一种新的子实体结构，为揭示葡萄酸腐病的发病进程提供了新理论。吴代东等（2016）研究表明，引起毛葡萄穗轴溃疡病的主要病原为小新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）；防治药剂筛选结果显示，30%氟硅唑微乳劑、64%嗯霜·锰锌可湿性粉剂、70%戊唑·丙森锌可湿性粉剂、70%代森锰锌可湿性粉剂、22.2%抑霉唑乳油、70%丙森锌可湿性粉剂和60%唑醚·代森联水分散粒剂等7种药剂对该病病原的抑制作用较强，抑菌率均达100%，可作为备选药剂进行田问防治试验。马仲文（2017）根据ITS序列的差异，建立了快速检测葡萄灰霉病菌的PCR检测方法，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作便捷等优点，可用于带菌土壤及发病组织中葡萄灰霉病菌的检测。[本研究切入点]目前对于葡萄果实溢糖性霉斑病的研究仍处于空白状态，对引发该病的原因尚不清楚。[拟解决的关键问题]对葡萄果实溢糖性霉斑发病园区的发病情况进行调查，初步了解该病的发病规律；挑取典型霉斑进行优势微生物分离、纯化、回接致病性验证及生物学鉴定，以确定引发该病的病原菌，为葡萄果实溢糖性霉斑病的防治提供参考依据。
1材料与方法
1.1病害调查与症状观察
田问病害调查于2015年12月、2016年7和12月在广西农业科学院巨峰葡萄一年两收示范基地进行。采用5点取样法，每点取果穗30穗，共150穗。
按果穗上果皮表面霉斑分布面积分5级记录。分级标准：0级，全穗无霉斑；I级，果穗上果皮表面霉斑分布面积占总面积比例≤20%；Ⅱ级，20%<果穗上果皮表面霉斑分布面积占总面积比例≤40%；Ⅲ级，40%<果穗上果皮表面霉斑分布占总面积比例≤60%；Ⅳ级，60%<果穗上果皮表面霉斑分布占总面积比例≤80%；V级，果穗上果皮表面霉斑分布占总面积比例>80%。
根据调查数据，计算病穗率和病情指数，计算公式如下：
1.2病原微生物分离
从采样园内选取巨峰葡萄的典型发病果穗，采用5点取样法，每点取果穗5穗，共25穗。整穗采集后置于无菌样品袋中于当日带回实验室。无菌条件下，从每穗样品上选取4个位置相对独立、形态典型性较好、表面形成肉眼可见孢子束的单一霉斑作为取样对象，共100个霉斑，用接种环挑取霉斑表面孢子，在孟加拉红琼脂培养基上进行划线分离纯化，置于28℃下培养72 h。随机从培养基上挑取形成的丝状菌单菌落进行平板划线二次纯化，再挑取所得单菌落接种于PDA斜面培养基上，置于28℃下培养72 h，观察斜面上长满孢子后将培养物置于4℃保藏。
1.3病原微生物鉴定
保藏的菌株用新鲜的PDA培养基进行培养，观察其培养性状，并在光学显微镜下观察其形态特征。同时，采用TaKaRa公司的Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.5.O试剂盒提取各分离菌株的基因组DNA，用Fungi Identification PCR Kit真菌鉴定试剂盒自带引物扩增真菌ITS序列并进行序列测定，测序测定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。利用BLASTN将获得的ITS基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行比对，确定与该菌株亲缘关系最近的种属，并从数据库获得相关种属的序列，用MEGA 5.0进行序列比对排列并使用邻接法（Neigh-bour-joining methods，NJ）构建系统发育进化树，以确定病原菌的分类学地位。
1.4病原微生物的致病性测定
将待测菌株PDA斜面培养物表面的孢子用无菌水洗下，收集到盛有10 mL无菌水及若干玻璃珠的50 mL三角瓶中，于28℃、160 r/min下振荡1 h，用4层擦镜纸过滤，用无菌水调节孢子浓度为1×106个/mL的孢子悬液。2017年夏季果成熟期间，从未发现霉斑病的试验地块中选取颗粒疏松、无颗粒相互挤压裂果的健康巨峰葡萄成熟果穗，用含0.1%（w/v）NaClO、0.01%（v/v）Tween-20的消毒液浸泡进行表面消毒，然后用无菌水冲洗3次并晾干，用无菌喷壶以喷雾接种的方法将孢子悬液均匀接种到健康果穗表面，以果穗上孢子悬液开始滴落作为接种终点，接种后果穗用无菌牛皮纸袋包扎，通过向纸袋定时喷洒无菌水保持袋内湿度，每个菌株接种3串果穗作为重复，以无菌水代替孢子悬液喷雾为对照，定期观察各果实表面霉斑的发生状况，发病后挑取单个霉斑进行病原菌分离，通过柯赫氏法则（韩召军，2012）验证病原菌。
2结果与分析
2.1田间生境与病症观察结果
生境：葡萄采用棚架模式栽培，架下环境较湿润，空气相对湿度在80%以上，园区中一半面积搭建了避雨棚，一半面积为露地栽培。
发病症状：病害发生于果实成熟期，通常在连日降雨、空气湿度较高时期发病；2015和2016年冬季果表现为避雨、套袋的果穗发病相对较少、较轻，2016年夏季果则表现为露地栽培、不套袋的果穗发病较少、较轻；该病害一般首先发生于果穗上部，随后逐渐向果穗下部蔓延；霉斑分布一般表现为同一果穗上部比下部多，同一果粒向外表皮上比向中心果梗一面的表皮上多；霉斑大多呈雪花状分散于果皮表面，局部严重的会形成一整片类似果粉的纤维薄膜状物质，霉斑周边的健康果粉消失（图1-a）。经观察比较，在园内相同片区，按现有大田生产技术，使用较大剂量赤霉素进行保果处理的果穗（表现为果梗粗硬老化，果粒较自然果更大）霉斑发生较严重，而部分本课题组用于试验、未经过赤霉素处理的自然坐果果穗极少发病。
2.2田间发病情况调查结果
田间葡萄果穗发病情况调查结果（表1）表明，葡萄果实霉斑在调查园内发病程度极高，病穗率在86.00%以上，造成大量果穗丧失商品价值。
2.3病原菌致病性鉴定结果
随机选取100个霉斑进行病原菌分离培养，结果在培养基上形成绝对优势的菌株均具有相似的菌落形态。依照柯赫氏法则，从100份培养物中随机选取8株分离菌株进行回接试验，结果显示，接种了分离菌株的巨峰葡萄健康果穗均表现出典型的霉斑症状，而空白组的果穗未出现霉斑。对回接试验中产生的果实表皮霉斑进行再分离，得到相似形态的分离菌株，表明该菌为引起巨峰葡萄果实表皮霉斑的病原菌。
2.4病原菌鉴定结果
将用于回接试验的病原菌代表菌株的ITS序列提交GenBank数据库进行BLAST比对分析，结果表明，该类菌株与橘青霉（Penicillium citrinum）的相似性达99%。由构建的系统发育进化树（图2）可知，编号为GX系列的病原菌菌株与从印度农作物及昆虫上分离得到的P.citrinum MSSRF-IS1在进化树的同一分枝上，而与由美国农业研究菌种保藏中心保藏的其他青霉属菌株存在一定差异。各病原菌代表菌株在PDA培养基上均具有下列形态学特点：菌丝呈绒状，单菌落有同心环纹，气生菌丝发达，培养3-5 d后长出灰蓝色孢子，菌落周围有淡黄色色素物质分泌（图3-a）；分生孢子梗直立、细长，单生或数根丛生，具有分隔，分枝呈帚状，较长或很长，多为双轮生；分生孢子呈球形或近球形（图3-b和图3-c），基本符合文献描述（孔华忠，2007）。根据形态学特征与分子生物学鉴定结果的相互印证，进一步证明分离所得的系列病原菌为橘青霉（P.citrinum）。
3讨论
葡萄果实溢糖性霉斑作为一种新的葡萄果实病害此前一直未引起业内重视。近年来，随着设施栽培技术的推广，我国南方湿润多雨地区的葡萄种植业快速发展，陆续有种植者反映在广西、浙江和台湾等地发现葡萄果实溢糖性霉斑。据本课题组调查发现，广西多地有葡萄果实溢糖性霉斑大面积发生现象，给种植户造成巨大经济损失。本课题组通过对发病果园的多年观察及连续三造果的病害发生情况分析发现，葡萄果实溢糖性霉斑病具有很强的顽固性，容易连续多年持续严重发生。
本研究从巨峰葡萄果实的霉斑中分离得到一系列菌落形态相近的菌株，经回接试验驗证其能引发果实霉斑，通过形态学鉴定及分子生物学鉴定，最终确定该系列菌株为橘青霉（P. citrinum），这是我国大陆地区首次报道分离并鉴定的与葡萄果实溢糖性霉斑相关的病原微生物。健康葡萄果实表皮上会附着大量的真菌微生物（Martins et a1.，2014；Kecske-meti et a1.，2016），通常青霉属微生物不易在活体葡萄果实表皮附生微生物群落中形成优势地位，推测葡萄果实溢糖性霉斑有可能是葡萄果实表皮附生微生态被某些因素破坏，从而造成青霉等丝状真菌形成生长优势所引发的病害。
橘青霉拥有强大的酶合成及代谢系统，能利用多种营养基质，能产生大量孢子，并借助空气流动迅速扩散，在潮湿条件下较易定殖生长，这些特点很可能是造成葡萄果实溢糖性霉斑持续发生的重要原因。前人的研究表明，橘青霉对杨梅、枣、葡萄等水果均能造成危害（Mikugova et a1.，2010；郭东起等，2011；汪开拓等，2011），但通常是在果实有伤口或在采后储藏过程中才会造成危害，在完整葡萄果实表皮形成霉斑的现象目前尚无报道。本研究发现，橘青霉在葡萄果实表皮形成霉斑后不会进一步引起果实溃烂；在返接试验中，未经生长调节剂处理的自然坐果果实不易遭受橘青霉的侵害，而经较大剂量赤霉素处理的果实较易形成霉斑病害，可能是外源赤霉素处理促使果实表皮通透性发生改变，为橘青霉的定殖提供了有利条件所致。
由于葡萄果实溢糖性霉斑病发病程度重且发生于果实成熟期，不宜采用化学药剂进行补救，因此目前只能通过提早采取措施进行预防：（1）做好园区排水和通风工作，防止出现地面积水，降低园区环境湿度；（2）及时清园并做好园区灭菌工作，减少可被青霉利用的生物基质；（3）在保花保果过程中控制植物生长调节剂、特别是赤霉素的用量，以免葡萄果实表皮的天然结构被破坏，减少橘青霉定殖于葡萄果实表皮的有利条件。综合考虑，葡萄果实溢糖性霉斑病的防治需从栽培技术人手做好综合防控工作，同时应开展生物防治该病的研究。
本研究对于葡萄果实溢糖性霉斑病的研究工作较粗浅，尚不能够对该病有系统和全面的认识，在后续研究中还需对该病的致病关键微生物的区域差异、发病内在机制、发病后处理方案等进行深入探究。
4结论
橘青霉（P.citrinum）是引起广西南宁巨峰葡萄果实溢糖性霉斑的病原菌之一，当前应从栽培技术人手做好综合防控工作。
（责任编辑 麻小燕）