摘要 利用16S rRNA基因序列分析方法对1株临床分离乳源菌进行鉴定并确定菌株的进化位置。抽提细菌DNA基因进行16S rRNA PCR扩增，并对扩增产物测序。成功扩增出长度为1 432 bp的核苷酸序列。该临床分离的乳源菌与GenBank上的已知序列进行了同源性比较，克隆到的序列与Y15856的同源性最低，为99.6%；与AB305019、D83353.1和FM875711.1的同源性最高，达99.9%。该试验菌为金黄色葡萄球菌且16S rRNA基因是高度保守的。利用16S rRNA基因序列分析鉴定细菌是一种快速、准确、方便的方法。
关键词 16S rRNA；基因序列；乳源菌；金黄色葡萄球菌；鉴定；系统进化
中图分类号 Q812 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）11-0291-03
DNA序列分析作为微生物鉴定的黄金指标，在众多DNA分析方法中应用广泛[1]。其中，rRNA含量大、种类少，是目前细菌系统分类学研究中最常用的。由于其功能和结构上的保守性，以及良好的时钟性质，可以用于鉴定生物进化的亲缘关系[2]。对于不同菌属、菌种遗传关系的远近，可以通过序列分析进行确定[3]。本研究中，利用从临床奶牛乳房炎分离到的1株细菌，进行16S rRNA基因分析、PCR扩增和测序，再通过测序结果与已知种属的16S rRNA基因序列进行同源性比较确定菌株的种类，最后通过系统进化比较，确定其进化位置。现将试验结果报告如下，以供同类研究参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌种。试验菌株从四川地区患有乳房炎奶牛的奶汁中分离。
1.1.2 供试培养基。Chapman′s 培养基、Mueller-Hinton（MH）琼脂培养基（购于微生物试剂有限公司，批号20061019），LB肉汤培养基、普通肉汤培养基（购于北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20071028）。
1.1.3 供试试剂。细菌基因组DNA抽提试剂盒（购于上海生工生物技术有限公司）、琼脂糖（购于成都溶海生物有限公司）、Premix-Taq和分子量标准物DL2000（购于Takara公司）、溴化乙锭（EB）（购于Sigma公司）、革兰氏染液。琼脂糖凝胶电泳所用溶液为10 mg/mL溴化乙锭（EB）贮存液、5×TAE电泳缓冲液、1.0%琼脂糖。
1.1.4 供试仪器。PCR仪（Eppendorf）、微量移液器（Eppendorf）、超净工作台（AIR TECH，苏净集团安泰有限公司），GL- 21M 高速冷冻离心机（BECKMAN）、DYY - 10C 型电泳仪、DYC- 31D型电泳槽（北京六一仪器厂），凝胶成像系统（美国UVP公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 试验菌培养特性。观察37 ℃普通培养基培养24 h的单个菌落的形态和生长特性，挑取单个菌落于1 mL普通肉汤中培养12 h后用无菌接种环划线接种于Chapman′s培养基37 ℃培养24 h，观察培养基颜色变化。挑取单个菌落进行革兰氏染色。在显微镜下观察其形态。
1.2.4 试验菌16S rRNA基因PCR扩增产物电泳检测。取量5 μL耐药金葡菌16S rRNA基因PCR扩增产物以1.0 %琼脂糖凝胶30～45 v/cm电泳检测，观察结果，阳性产物于-20 ℃保存。
2 结果与分析
2.1 试验菌培养特性培养特性观察结果
普通培养基37 ℃培养24 h的菌落呈湿润、光滑、隆起的圆形菌落。在普通肉汤中培养12 h生长迅速，初浑浊，管底有少量沉淀，轻轻振荡，沉淀物上升，旋即消失。Chapman′s培养基37 ℃培养24 h后，培养基由红色变为黄色。
2.2 试验菌16S rRNA基因PCR扩增产物
2.3 试验菌16S rRNA PCR扩增产物的序列测定
试验中，PCR扩增产物经鉴定为阳性，然后将其进行测序（由大连宝生物公司完成）。测序结果表明，送检的DNA片段为1 432 bp，与预期的结果相符。
2.4 16S rRNA基因核苷酸序列同源性比较与分析结果
2.5 16S rRNA基因的系统进化树分析
3 结论与讨论
本试验通过对1株从临床奶牛乳房炎分离到的细菌进行了培养特性观察以及对16S rRNA基因片段PCR扩增和测序，与GenBank上的已知序列进行了同源性比较。试验结果表明：试验菌生长特性和镜检结果可以初步判断为葡萄球菌，16S rRNA核苷酸序列与GenBank上的已知序列进行了同源性比较，同源性均>99.0%。根据同一种内不同株间基因>99%，不同属细菌16S rRNA基因同源性为70%～90%的原则，可鉴定该试验菌为金黄色葡萄球菌。
与预期相比，此次试验中对PCR扩增产物的测序结果，其片段相对较小。分析其原因，可能是背景干扰PCR产物直接测序，如果有必要，为保证测序结果的准确性，应当采用克隆测序。国内关于16S rRNA序列分析鉴定细菌的研究已经开展较多。张浩吉等[5]采用真细菌的通用引物进行16S rRNA基因扩增，并作了克隆和测序分析。其结果与确诊一致，鉴定菌株为猪附红细胞体，同源性高达99.52%。刘文华等[6]在临床中对病鸭的研究表明，通过比较菌株同源性来确定其种类，同源性高达98.6%，验证分离菌株为链球菌。本试验中的结果与文献报道一致，通过同源性对比，结果可达99.6%～99.9%。
利用16S rRNA恒定区序列特别保守的特点，在恒定区设计引物，从分子水平鉴定与分类，比较及分析细菌16S rRNA。16S rRNA基因约1 500个核苷酸，大小适中，既能利用测序技术较容易地得到其序列，又能体现不同细菌种属间的差异，便于序列分析。此外，近年来已经积累大量细菌16S rRNA基因序列数据库。应用16S rRNA作为研究对象，采用以PCR为基础的多种分子生物学分析手段的联合应用，可以克服传统的细菌检测方法存在的多种缺点，如敏感度低、特异性差、耗时长等[7]。该技术结合核酸序列分析不仅可检测与鉴定已知细菌，还可广泛用于样品中未知菌的检测与鉴定，实现快速、微量、准确地对微生物进行检测，对微生物菌群的组成结构进行定性甚至定量的跟踪监测。本试验通过对1株从临床奶牛乳房炎分离到的细菌16S rRNA基因片段进行了扩增和测序，与GenBank上的已知序列进行了同源性比较，同源性均>99.0%，证实试验菌为金黄色葡萄球菌，结果证实，16S rRNA基因在菌株鉴定中独特的优势，具有客观、准确等优点，弥补了生化鉴定敏感性低、结果不稳定的缺点。随着相关技术的迅速发展，可以不断提高其测序准确性，使16S rRNA技术成为为细菌鉴定的常规检测方法。进化树对了解病毒的基因型和流行病学研究均有重要意义。通过对进化树的分析研究，可以实现对蛋白或基因在进化过程中的演变和亲缘关系的评价。进化树可以展现拓扑图形或者分支层次，因此可用于粗略估计不同类群生物之间的进化关系，并反映物种之间的进化距离[8]。根据其基因序列，可用进化树分析其可能的病原体来源，即使在病原微生物未分离成功时也可实现。本试验从试验菌16S rRNA的进化树上看，可将12个菌株分为2个大群（Group），四川地区流行的耐药株与日本、欧美菌株有较近的亲缘关系。此次试验的研究结果可以为今后从基因水平上，实现金黄色葡萄球菌的快速鉴定提供重要依据。
4 参考文献
[1] 张守印，李振军，张集，等.16S rRNA基因序列分析在非典型菌株鉴定中的应用[J].中国卫生检验杂志，2008，18（4）：616-620.
[2] 高岚，熊浩山，彭莉，等.以16S rRNA为基础的检测技术在肠道菌群研究中的应用[J].中国畜牧杂志，2008，44（15）：55-59.
[3] 李鹏，马艳娇，赵云.16S rRNA、23S rRNA及16S-23S rRNA基因在细菌分离与鉴定中的应用[J].现代畜牧兽医，2008（7）：48-52.
[4] CHENG L，ZIEGELHOFFER P R，YANG N S，et al. In vivo promoter activity and transgene expression in mammlian somatic tissuse evaluated by using particle bombardment [J]. Proc Natl Acad Sci USA，1993（90）：4455-4459.
[5] 张浩吉，谢明权，张健騑，等.猪附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析[J].畜牧兽医学报，2005，36（6）：596-601.
[6] 刘文华，王晓雷，邹玲，等.16S rRNA基因序列分析对鸭源链球菌的鉴定[C]//中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集.扬州：[出版者不详]，2008：676.
[7] 卢受昇，孔令辰，罗晶璐，等.鸭链球菌的分离鉴定及其16S rRNA基因序列分析[J].中国兽医杂志，2013（2）：30-33.
[8] 杨霞，陈陆，王川庆.16SrRNA基因序列分析技术在细菌分类中应用的研究进展[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2008，36（2）：55-59.