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摘要：根据NCBI上传的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）[GenBank：JN547228（CH/S）]，设计引物对阳性病料进行鉴定并回收，与pMD18-T构建重组载体并测序。对猪流行性腹泻病毒的基因多样性及序列保守性进行分析，一是以经典毒株为主，包括CV777、KPEDV-9和CH/S株等为代表的G1基因型，另一种是以近几年分离的毒株为主，包括HB3-CH2012、CXHZ-CH2013、HNCZ-CH2013等为代表的G2基因型。基因同源性分析比较结果表明，这4株PEDV之间的序列同源性为97.6%～100.0%，与经典株CV777的同源性为92.7%～92.8%。同源分析显示，PEDV不同毒株间的基因同源性仍高度相似，但PEDV流行毒株已呈现进化分支的趋势。
关键词：猪流行性腹泻病毒;S基因;序列分析
中图分类号：S858.285.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）11-0071-03
猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea，PED）是一种高死亡率的肠道传染病，会在猪群中引起各个年龄段猪暴发急性腹泻，多发于仔猪和胎猪，其临床症状主要以猪水样腹泻、呕吐和脱水为主。1971年，英国首先报道了PEDV的暴发流行[1]，随后在比利时、德国、瑞士、日本、韩国等许多养殖大国出现报道[2-3]。1976年，中国大陆首次报道PED的发生与流行，1984年通过免疫荧光试验证实病原微生物为猪流行性腹泻病毒[4]。20世纪80年代后，我国不断有PED发生，其中26个省（市、自治区）都曾发生。20世纪90年代后期，猪传染性胃肠炎（华毒株）和猪流行性腹泻（CV777）二联灭活苗或弱毒苗，在我国开始大范围使用并取得良好免疫效果[5]。国内外对该病的研究和重视程度均远远不够，我国甚至没有把猪流行性腹泻列为国家动物法定传染病的一、二和三类疫病[6]。自2006年后，以经典毒株CV777基础研制的灭活苗或弱毒苗免疫效果下降，免疫过的猪场还出现多次猪流行性腹泻病的暴发。2010年起，猪流性腹泻病开始在全国大部分的主要养殖区出现，导致初生仔猪死亡率高达90%以上，全国仔猪死亡估计有上千万头[7-8]，给生猪养殖业造成了难以估量的经济损失。
PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属，其中冠状病毒属分为α、β、γ、δ 4个群[9]，猪流行性腹泻属于冠状病毒α群，猪流行性腹泻基因组是单股正链具有感染性的RNA，其基因组大小为28 kb左右，其中S基因编码的S蛋白是一种跨膜糖蛋白，位于病毒表面。S蛋白与细胞受体结合、病毒融合，最重要的是，在诱导中和抗体方面和病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞方面发挥关键作用[10-11]。通过分析比对猪流行性腹泻病毒S基因分离株与经典株之间核苷酸和氨基酸的同源性、抗原表位差异、糖基化位点及跨膜域差异性，以期为预防和控制猪流行性腹泻暴发流行提供理论数据支撑。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
Trizol LS Reagent，购自美国Invitrogen公司产品;pMD18-T载体克隆试剂盒、DL 2000 DNA Marker、rTaq酶、RNA酶抑制剂（HPRI）、dNTP、反转录酶（AMV）、UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，均购自生工生物工程（上海）有限公司;BamH Ⅰ及Hind Ⅲ限制性内切酶，均购自宝日医生物技术（北京）有限公司;DH5α大肠杆菌感受态细胞由实验室保存。本研究于2016年在河南城建学院分子生物学实验室完成。
1.2 引物的设计和合成
根据NCBI数据库GenBank中发表的JN547228基因序列，设计并合成S基因测序引物，引物序列见表1。
1.3 模板的制备
取来自发病猪的病变组织细胞匀浆液，按Trizol LS Reagent使用说明，提取病毒RNA，将提取物RNA置于 -20 ℃ 冰箱保存。
1.4 RT-PCR
将设计好的下游引物1.0 μL，0.4 μL Rnase-Inhibitor，5.0 μL dNTP，4.0 μL 5×AMV Buffer，1.0 μL AMV，加入 10.0 μL RNA，42 ℃水浴1～2 h，即得cDNA模板，-20 ℃保存备用。
1.5 目的片段S基因的扩增
取cDNA产物1.0 μL作为模板进行PCR扩增，扩增体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，rTaq酶0.5 μL，PEDV-S-sense/PEDV-S-anti-sense各0.5 μL，用灭菌ddH2O补足25.0 μL。PCR扩增反应条件为：95 ℃预变性 5 min;94 ℃ 50 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，共进行35个循环;最后72 ℃延伸10 min。RT-PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。
1.6 目的基因的克隆及序列測定
将扩增的RT-PCR产物，回收产物与载体pMD18-T进行连接，连接产物转化到感受态细胞DH5α中，挑选阳性菌落于100 mL液体LB（含A+）液体培养基中，放置于37 ℃恒温摇床培养过夜，用碱性法提取重组质粒。并用双酶切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切重组质粒，阳性质粒进行测序。
1.7 基因序列分析
利用Clustal 1.83和MEGA 5.05软件对猪流行性腹泻病毒的基因多样性及序列保守性分析，绘制毒株的系统进化树。
2 结果
2.1 目的基因的扩增
RT-PCR扩增毒株，显示与预期片段1 058 bp相似大小的特异片段（图1）。
2.2 组质粒的酶切鉴定
用BamHⅠ、HindⅢ限制性内切酶对重组质粒pMD18-PEDV-S进行双酶切鉴定，将酶切产物用凝胶核酸电泳得到预期大小约1 058 bp和2 000 bp以上的2条电泳条带（图2）。
2.3 DNA序列测定
酶切鉴定阳性pMD18-PEDV-S克隆质粒送上海生工生物工程有限公司测序，将测序序列通过Blast双重比对，分析表明pMD18载体已插入PEDV-S基因。
2.4 氨基酸的序列多样性、同源性分析
从NCBI数据库中下载经发表的20株国内外毒株序列，与4个分离株（PEDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3、PEDV-HN4）PEDV-S基因序列进行核苷酸和氨基酸的同源性分析（表2）。
2.5 PEDV-S系统发育进化树
PEDV-S基因序列同源性比较的系统发育进化树见图3。
3 分析与讨论
猪流行性腹泻病毒刺突蛋白S基因保守性非常高，是主要的抗原表位所在域，PEDV-S基因结构和功能与该病毒的致病性、感染性、中和抗体的产生和细胞结合能力密切相关[12-13]。本研究表明，PEDV流行毒株的刺突蛋白基因不论在基因和蛋白质同源性上，还是在系统进化树上，与PEDV经典毒株CV777、DR13等疫苗株均存在显著差异，其基因的保守同源性只有92.7%～92.8%，從PEDV-S基因的系统进化树上可以看出，PEDV流行毒株与经典疫苗株分为不同的组群，表明PEDV流行毒株与经典疫苗株抗原表位的刺突蛋白S出现了基因多样性及保守性的变化[14]。
3.1 PEDV-S基因同源性分析
Meg Align软件进行同源性分析，PEDV进化上主要有G1和G2这2个基因组型，G1型以经典毒株为主，包括CV777、KPEDV-9和CH/S株等，G2型则以近年分离的毒株为主，包括HB3-CH2012、CXHZ-CH2013、HNCZ-CH2013等。PEDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3和PEDV-HN4的同源性为97.6%～100.0%，与参考病毒株CV777、DR13、KPEDV-9等的同源性为92.6%～93.3%。
分离株PEDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3和PEDV-HN4与参考病毒株CV777相比，比经典毒株多2个插入突变和1个缺失突变，其中一个插入部位在流行毒株的第58～59位之间插入（QGVN），另一个插入部位在流行毒株139～140（N），流行毒株62～164（KNI）位存在缺失突变，与经典毒株CV777蛋白质同源性相比，分离株的多个氨基酸位点发生突变，共有65个位点发生氨基酸突变：第2～5位（TPLI→KSLT）、第15位（L→T）、第27～30位（QSTI→SANT）、第64位（S→T）、第68～74位（GTGIETD→AGQHPTA）、第86～87位（DS→RG）、第89位（Q→H）、第118位（S→N）、第138位（V→A）、第157～163位（LQDGKNI→HSEHS-—）、第200～202位（KRS→SGG）、第210位（T→E）、第227～229位（SYQ→YYE）、第236位（S→Y）、第246～247位（DS→EP）、第270位（L→V）、第286位（W→L）等。
3.2 PEDV-S基因蛋白抗原位点变化
ExPASy分析经典毒株CV777的S蛋白抗原表位表明，它有51个潜在的抗原位点，而PEDV-HN1株预测存在56个抗原位点，PEDV-HN4株存在57个抗原位点，PEDV-HN2和PEDV-HN3株均含有54个抗原位点。与参考毒株CV777相比，分离株PEDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3和PEDV-HN4在130～136位缺失1个抗原位点，而新增加的抗原位点（第159～165位氨基酸、第191～199位氨基酸和第631～610位氨基酸）主要出现在猪流行性腹泻病毒的S1区。
3.3 PEDV-S基因蛋白糖基化位点变化
ExPASy分析PEDV S蛋白糖基化位点可知，CV777及PEDV-HN2株中存在29个N-糖基化修饰位点，而 PEDV-HN1、PEDV-HN3、PEDV-HN4株含有28个N-糖基化位点。4株分离毒株与CV777相比，其N-糖基化位点出现3处改变，第57位氨基酸由NSSS变为NSTW，第1196位氨基酸增加了1个N-糖基化位点NHTA，第230位氨基酸有1个N-糖基化位点缺失NCTG。
3.4 PEDV-S基因跨膜螺旋法
通过SOSUI预测PEDV S蛋白跨膜螺旋区分析可知，经典毒株CV777在第1331～1356位氨基酸形成了首个跨膜螺旋域，在第2～24位氨基酸形成第二次跨膜螺旋域。而PEDV-HN1和 PEDV-HN4毒株在第1337～1359位氨基酸形成首次跨膜螺旋域，在第1～23位氨基酸形成第二次跨膜螺旋，PEDV-HN2和PEDV-HN3在第1328～1350位氨基酸形成了首次跨膜螺旋域，在第1～23位氨基酸和第 1356～1378位氨基酸分别形成了第二次跨膜螺旋域[16]。
3.5 PEDV-S基因的遗传演化趋势
Meg Align软件进行同源性分析，猪流行性腹泻病毒进化上可以分为G1和G2这2个不同的基因组型。同源分析的24株PEDV中，9株PEDV为G1基因组型，占37.5%，15株PEDV为G2基因组型，占62.5%。近年，PEDV主要的流行优势毒株也位于G2基因组型中，G1基因组型主要是经典CV777、DR13、KPEDV等疫苗株以及我国发现的部分毒株。最近出现的流行株G2群，除在我国发现外，也出现在东北亚国家日本和韩国，此次分离鉴定的4株毒株均属于G2群，我国近年分离的PEDV流行毒株与G2群同源性最高，结果说明我国跨地域的生猪调配导致不同区域的毒株之间存在交叉感染基因重配，可能与PEDV的传播和致病有一定相关性。系统进化树进化不同分支的时间显示，不同时代鉴别的PEDV流行毒株有相同的进化方向，并不存在明显的时空聚集性[15]。
猪流行性腹泻病是严重影响我国养猪业发展的重要传染病之一，给生猪饲养、育种等造成巨大的经济损失。在很长一段时间内由于疫苗的使用减少了该病的感染，但同时由于疫苗长期使用导致PEDV的基因发生突变[17]。通过本研究发现，目前我国广泛流行的猪流行性腹泻病毒株与以往经典毒株相比已经存在一些在基因序列及蛋白结构方面的明显差异，这可能是疫苗免疫失败的主要原因之一。
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