摘 要 采用盆栽试验结合传统的土壤微生物多样性研究方法，探讨了不同茄科蔬菜轮作对高发枯萎病蕉园土壤中可培养细菌、放线菌、真菌和尖孢镰刀菌数量的影响。结果表明：香蕉连作后，土壤中真菌和尖孢镰刀菌数量显著增加，分别为连作前的16.53和1.92倍；与香蕉连作相比，辣椒和茄子轮作后，土壤中细菌数量分别显著增加了5.02和2.82倍，真菌分别显著降低了96.31%和98.42%，尖孢镰刀菌数量分别显著降低了87.84%和81.36%，但对放线菌数量的变化影响不显著；与香蕉连作相比，辣椒和茄子轮作显著提高了土壤中的放线菌/真菌[Actinomycetes/fungi（A/F）]和细菌/真菌[Bacteria/fungi（B/F）]值，且均显著增加了土壤中具有拮抗香蕉枯萎病病原菌功能的芽孢杆菌和假单胞菌的数量。
关键词 枯萎病；连作；轮作；茄科蔬菜；尖孢镰刀菌
中图分类号 Q939.96 文献标识码 A
Effects of Different Solanaceae Crop Rotations on
the Soil Culturable Microbes in an Orchard with
Serious Fusarium wilt Disease
ZHAO Na1，LI Rong2，XIN Kan1，ZHAO Yan1，RUAN Yunze1*，FU Changming1*
1 Hainan University，Haikou，Hainan 570228，China
2 Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095，China
Abstract A pot experiment was performed to investigate the effect of crop rotation with different Solanaceae cultivars on the number of culturable rhizosphere bacteria，actinomycetes，fungi and Fusarium oxysporum in the soil collected from an orchard with serious fusarium wilt disease. Results showed that after banana continuous cropping the number of culturable rhizosphere F. oxysporum and fungi significantly increased，the values of which at the end of the pot experiment was 16.53 and 1.92 times compared to before planting. After crop rotation with pepper and eggplant，compared to before planting， the number of culturable rhizosphere bacteria increased by 5.02 and 2.82 times， while the number significantly decreased by 96.31% and 98.42% for fungi and by 87.84% and 81.36% for F. oxysporum，respectively，however，no significant difference of the number of actinomycetes was observed. Compared with banana continuous cropping，crop rotation with pepper and eggplant significantly improved the soil Actylomyces/Fungi and Bacteria/Fungi values，and increased the number of antagonistic Pseudomonas and Bacillus species.
Key words Fusarium wilt；Continuous cropping；Crop rotation；Solanaceae vegetables；Fusarium oxysporum
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.003
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型[Fusarium oxysporum f. sp. cubense（E. F. Smith） Snyder and Hansen（FOC）]侵染引起的土传维管束病害[1]，近年来在中国香蕉主产区持续暴发并不断扩大，造成巨大的经济损失，严重威胁了中国香蕉产业的可持续健康发展[2-3]。由于气候条件的限制，中国可种植香蕉的耕地面积原本就小，若再不采取有效的防治措施，中国香蕉产业将面临严峻形势[4]。
轮作能够为农业生产带来许多优点和多重功能，能够保存、维持和补充土壤资源，包括有机质、养分及其他的物理化学特性[5-6]。目前已有大量关于适宜作物通过与病原菌非寄主植物的轮作而显著降低土壤中的病原菌数量[7]、克服连作生物障碍的报道[8]。Peters等[9]研究证明大麦、红三叶草与土豆轮作3年后，土豆根茎溃腐病和黑腐病的发病率显著低于大麦、土豆2年轮作区域。Subbarao等[10]通过甘蓝和西兰花的轮作，降低了连作草莓土壤中病原菌的数量，抑制了黄萎病的发生。油菜和小麦轮作能够很好地降低小麦全蚀病的发病率[11]。Larkin等[12]采用不同绿肥与土豆进行轮作，均能降低土豆不同连作土传病害的发病率。但目前关于不同轮作体系对香蕉连作障碍影响的研究较少，有研究者尝试用韭菜轮作防控香蕉枯萎病[13-15]，取得了一定的效果。但随着中国香蕉种植面积日益扩大，连作障碍越发严重，仅仅依靠1～2种作物来维持香蕉轮作体系，远远不能解决问题。开发出更多的解决香蕉连作障碍的有效轮作体系，阐明不同有效轮作体系、重建香蕉根际健康的土壤微生物区系及防控香蕉连作生物障碍的机制，是确保中国香蕉产业可持续发展的重要支撑。
本研究利用平板分离培养技术，研究了香蕉在不同轮作模式下根际土壤中细菌、放线菌、真菌、尖孢镰刀菌、芽孢杆菌、假单胞菌的群落多样性，旨在分析不同轮作模式对土壤可培养微生物群落结构多样性的影响，以期为克服香蕉连作障碍、实现农田的可持续发展提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病原菌 供试香蕉枯萎病病原菌由南京农业大学提供。
1.1.2 土壤 为海相沉积物发育的燥红土，采自海南万钟公司万亩蕉园连作香蕉15 a的地块（东经108°46′，北纬18°39′），基本性质为：有机质 5.09 g/kg，碱解氮 25.20 g/kg，速效磷 39.75 mg/kg，速效钾140.00 mg/kg，pH 7.0。
1.1.3 香蕉品种 为‘农科1号’（中感香牙蕉品种），由海南万钟实业有限公司提供。
1.1.4 辣椒 为琼辣2号，由海南省农业科学院蔬菜研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 盆栽试验设计 盆栽试验于2012年7月21日至2012年10月20日（共90 d）在海南省乐东县香蕉枯萎病研究所实验大棚内进行，设3个处理：（1）连作土壤轮作辣椒；（2）连作土壤轮作茄子；（3）连作土壤轮作番茄，同时设立香蕉连作为对照。每个处理分3个区组，每区组10次重复。待辣椒、茄子和番茄幼苗长至2叶1心期，选择长势一致的幼苗连同营养钵中的蛭石一起移至盆钵中，每盆装载5 kg 病原土，按3%（W/W）的比例施加牛粪作为底肥，每盆钵移栽2棵幼苗。当香蕉幼苗长至4～5片真叶时，选择长势一致的幼苗连同营养钵中的蛭石一起移至上述盆钵中，每个盆钵移栽一棵幼苗。采用常规水肥管理。
移苗后每隔30 d采集土壤样品，每个处理的每个区组随机取作物3株，每处理共取9株作物为3个混合土样，于4 ℃下保存备用。
1.2.2 土壤微生物测定 土壤可培养微生物的数量通过平板稀释涂布法测定[16]。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养；真菌采用马丁氏培养基；放线菌采用改良的高氏一号培养基；尖孢镰刀菌采用K2培养基；芽孢杆菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，涂布前将土壤悬液置于80 ℃水浴锅中加热30 min；假单孢菌采用PSA培养基[15]。
1.2.3 具拮抗能力假单胞菌、芽孢杆菌数量的测定 采用平板对峙培养法计数对香蕉枯萎病病原菌具拮抗能力的假单胞菌和芽孢杆菌。用5 mm的打孔器从已活化的病原菌菌落前沿取圆形菌丝块，用接种针将其接种至PDA平板中央，于28 ℃下黑暗培养1 d。待测拮抗菌选自同一梯度涂布的平板，用灭菌牙签从平板的一侧随机挑取待测假单胞菌和芽孢杆菌各100株，等距离（2 cm）按对角线法接于病原菌菌饼周围，每平板接种4株，以不接种待测菌为对照，每处理3次重复，分别于培养箱中以 30 ℃培养 4 d 后观察记录抑菌圈的有无及抑菌圈直径。挑选有抑制效果的菌株经平板画线纯化保存，计算抑菌率[17]。
抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%
1.3 数据分析
数据统计分析使用Excel 2007和SAS 9.0软件，通过Duncan新复极差法检验处理间差异的显著性水平。
2 结果与分析
2.1 连作与轮作土壤中尖孢镰刀菌数量的变化
香蕉连作中，尖孢镰刀菌的数量除60 d时略有下降外，大体上随移栽时间的延长而呈上升趋势，移栽90 d时尖孢镰刀菌数量最大，达到 6.33×104 cfu/g 干土；辣椒和茄子轮作处理中，尖孢镰刀菌的数量随移栽时间的延长呈现下降趋势，移栽30 d时2处理土壤中尖孢镰刀菌的数量差异达到显著水平，移栽90 d时数量均达到最低，分别为0.77×104 cfu/g和1.18×104 cfu/g 干土，且两者间无显著性差异，但均显著低于香蕉连作，分别降低了87.84%和81.36%，表明辣椒和茄子的轮作均能够更有效地降低高发病土壤中尖孢镰刀菌数量；而番茄处理中，随着移栽时间的增加，其根际土壤中尖孢镰刀菌数量变化趋势与对照一致，呈现呈上升的趋势，且始终显著高于对照土壤中尖孢镰刀菌的数量，90 d时番茄轮作土壤中尖孢镰刀菌的数量达到8.34×104 cfu/g（图1）。
2.2 连作与轮作土壤中细菌数量的变化
香蕉连作土壤中可培养细菌的数量呈现先增加后减少的趋势，移栽30 d时数量达到最大（11.7×106 cfu/g干土），90 d时数量又降为5.03×106 cfu/g干土；辣椒和茄子轮作处理中，随着移栽天数的增加，土壤中细菌的数量呈现不断增长的趋势，移栽90 d时细菌的数量达到最高，分别为30.3×106、19.2×106 cfu/g干土，显著高于香蕉连作，分别为香蕉的6.02和3.82倍；而番茄轮作土壤中细菌的数量在移栽30 d时达到最高值即9.54×106 cfu/g干土，90 d时数量又降为4.46×106 cfu/g干土，显著低于辣椒和茄子轮作处理，但与香蕉连作无显著性差异（图2）。结果表明，与对照和番茄轮作相比，茄子和辣椒的轮作均能够更有效地增加根际土壤可培养细菌的数量。
2.3 连作与轮作土壤中放线菌数量的变化
香蕉连作土壤中放线菌数量呈上升趋势，90 d时数量达到最大，为9.78×105 cfu/g干土，显著高于其他蔬菜轮作处理。辣椒、茄子和番茄轮作处理中，放线菌数量的变化呈现无规律波动（图3）。
2.4 连作与轮作土壤中真菌数量的变化
随着香蕉连作时间的增加，真菌的数量与尖孢镰刀菌数量变化趋势一致，大体上呈现出增加的趋势，在移栽60 d至90 d之间，数量增长了6.3倍，达到79.2×104 cfu/g干土，显著高于其他蔬菜轮作处理；辣椒轮作处理中，真菌数量相对稳定，移栽90 d时数量为2.92×104 cfu/g干土；茄子轮作处理中，随着移栽时间的增加，土壤中真菌的数量不断降低，移栽90 d时数量为1.25×104 cfu/g干土，低于其他轮作处理，但与辣椒轮作差异不显著；番茄轮作土壤中真菌数量呈现出增加的趋势，90 d时达到10.9×104 cfu/g干土，显著高于辣椒、茄子轮作处理。结果表明，与对照和番茄轮作相比，茄子和辣椒的轮作均能够更有效地降低根际土壤可培养真菌的数量（图4）。
2.5 不同蔬菜轮作对土壤Actinomycetes/fungi（A/F）和Bacteria/fungi（B/F）的影响
由表1可知，香蕉连作、番茄轮作均导致土壤A/F值下降，在移栽90 d后分别下降到1.24和1.11；辣椒和茄子轮作均使土壤中的A/F值大幅度升高，90 d时，显著高于香蕉和番茄轮作处理，数量值分别为10.69和26.84。香蕉连作和番茄轮作同样降低了土壤的B/F值，移栽90 d后，分别为6.35和40.79；辣椒和茄子轮作均增加了土壤的B/F值，其中茄子轮作土壤中B/F值升高幅度最大，是种植前的11.38倍，该2种作物轮作90 d后的B/F值分别为香蕉和番茄轮作的164.92、25.67倍与243.59、37.92倍。
2.6 不同蔬菜轮作对土壤中具拮抗能力的假单胞菌和芽孢杆菌数量的影响
平板分离得到的假单胞菌和芽孢杆菌在实验室条件下，部分菌株对香蕉枯萎病病原菌的生长均有不同程度的抑制作用（表2），平均抑菌率因轮作作物的不同而达到显著差异水平。辣椒和茄子轮作土壤中具有拮抗能力的芽孢杆菌和假单胞菌的平均抑制率均显著高于香蕉连作和番茄轮作土壤；从拮抗比率分析得知，轮作辣椒和茄子土壤中的具有拮抗性的芽孢杆菌和假单胞菌的数量分别是香蕉连作土壤中的6.3和11.0倍与5.0和6.0倍。实验结果表明辣椒和茄子轮作能够显著增加土壤中具拮抗能力的芽孢杆菌和假单胞菌的数量。
3 讨论与结论
土壤微生物区系在土壤的养分和物质循环、形成和发育、肥力维持与提高等过程中起着重要的作用，不仅能较早地预测土壤质量的变化，还决定着土壤的质量。连作障碍发生主要与土壤传染性病害、土壤理化性状劣变以及由根系分泌物和残茬分解物等引起的自毒作用等有关，而这些因子均与土壤中的微生物有一定关联[18-21]。吴宏亮等[22]针对砂田西瓜连作障碍现状进行定位试验，通过西瓜与花豆、辣椒、南瓜轮作发现，这3种轮作模式均可改善土壤微生物区系结构，增加细菌、放线菌数量；刘新晶等[23]研究发现麦-米-豆轮作土壤中氨氧化细菌、好气性自生固氮菌和好气性纤维素分解菌等生理菌群的数量显著高于大豆15年连作。本研究结果与前人结果一致，随着香蕉连作时间的增加，土壤中可培养细菌菌群数量不断下降，且连作时间越长下降幅度越大；辣椒、茄子轮作则增加了土壤中可培养细菌的数量。香蕉连作土壤中放线菌数量则随移栽时间的增加而增加，这与尹睿等[24]研究蔬菜地连作时发现土壤中微生物区系产生了极大的变化而放线菌数量却显著增加的结论一致。辣椒、茄子轮作对放线菌的数量没有显著影响，这与闫志山等[25]关于甜菜轮作和吴宏亮等[22]的研究结论（轮作有助于土壤中放线菌数量增加）相违，具体原因仍需进一步研究。
植物的病原菌中70%为真菌，故土壤中真菌数量增加及其所占比例提高是土壤退化、致病性提高的标志[26-27]。本实验结果表明，真菌菌群密度在香蕉连作土壤中大幅增加，尤其是尖孢镰刀菌的数量增加极其显著，表明选择性富集于此土壤微环境中的尖孢镰刀菌类群开始形成优势菌群并对其他种群产生抑制作用，导致真菌多样性水平降低，与不同蔬菜轮作相比差异达到显著水平。辣椒轮作在一定程度上减少了土壤中真菌的数量，尤其对降低与香蕉枯萎病相关的尖孢镰刀菌的数量效果显著，这一结论与于高波等[28]初步认为轮作处理减少了结瓜后期的根际土壤真菌种类的结论相一致。
细菌在生物防治中起着重要的作用，包括荧光假单孢菌、假单孢杆菌、芽孢杆菌和链霉菌等。本研究中的假单胞菌和芽孢杆菌平板对峙实验结果表明，连作土壤中具有拮抗香蕉枯萎病病原菌能力的拮抗菌数量显著低于轮作土壤，轮作平均抑菌率与连作达到显著性差异。初步推断轮作增加了土壤中有益微生物的数量，增强了土壤抵御病原菌的能力。
土壤中细菌和真菌的比值（B/F）与放线菌和真菌的比值（A/F）是土壤微生物区系结构中重要的特征指标。有研究表明，土壤中真菌数量增加而导致A/F和B/F 比值减小，将不利于作物的生长，是土壤土传病害增加的可能原因之一[29]。本研究中，随移栽时间的增加，香蕉连作土壤真菌数量呈现增加的趋势，导致A/F值降低，随着细菌数量的降低，真菌数量的增加，B/F值也在下降。而辣椒、茄子轮作土壤中真菌数量随着种植时间的增加而不断降低，且放线菌数量也略有升高，细菌数量显著提高，与香蕉连作相比能极显著地提高土壤中的A/F和B/F值，而番茄轮作则截然相反，辣椒、茄子轮作和香蕉连作相比差异达显著水平。
盆栽试验研究结果表明，辣椒和茄子轮作与香蕉连作相比能够显著降低根际土壤中尖孢镰刀菌和真菌的数量，同时显著增加了土壤中可培养的细菌、放线菌的数量，从而提高了土壤中A/F和B/F的比值，改善了土壤微生物区系失衡现象；轮作也使土壤中有拮抗功能的有益芽孢杆菌和假单胞菌的数量显著增加，可能有利于克服香蕉的连作障碍，但具体效果需要田间试验的进一步研究验证。
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