摘要：介绍了一例奶牛支原体和大肠杆菌混合感染病例的诊治情况。通过实验室检查，对该牛场送检病牛的各种脏器组织分别进行了病原微生物学检查、病原体的分离培养、主要致病菌的分离鉴定、细菌纯培养物的染色镜检、药物敏感性试验等检测项目，确诊为由支原体和致病性大肠杆菌混合感染所致的传染性病例。
关键词：支原体；大肠杆菌；混合感染；实验室诊断；奶牛
中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）12-0005-03
近年来，宁夏地区多个奶牛场发生了以呼吸系统疾病和关节肿大为主要特征的病例，病牛表现为突然发病甚至死亡，对牛场产奶量造成巨大的经济损失[1]。2013年6月宁夏回族自治区银川市某奶牛场发生了一起以成年母牛张口呼吸，呼吸频率显著增加，右前肢关节肿大导致死亡，随后一只3月龄犊牛同样出现呼吸道症状并且死亡。对该牛场送检病牛的各种脏器组织，分别进行了病原微生物学检查、病原体的分离培养、主要致病菌的分离鉴定、细菌纯培养物的染色镜检、药物敏感性试验等检测项目，确诊为由支原体和致病性大肠杆菌混合感染所致的传染性病例，现将结果报告如下。
1 临床症状
成年母牛呼吸异常，出现张口呼吸，呼吸频率显著增加，可见右前肢关节肿大，于产前2周发生流产；犊牛表现为精神不振，出现呼吸道症状，关节明显肿大。
2 病理学诊断
解剖病死牛观察其病理变化。成年母牛肺脏苍白，体积显著萎缩，表面多皱褶，肺间质显著萎缩，肺脏缺乏充盈感或膨胀感；肺门淋巴结略有肿大、充血，切面暗红色（图1）；右前肢关节液显著增多，颜色发黄甚至浑浊；肝脏颜色变深，质地变脆，体积肿大边缘钝厚，在不同部位呈现大小不等灰白色炎性病灶（图2）。发病犊牛经剖检后，可观察到病牛肺脏体积肿大，出现纤维素性炎症及出血性炎症，质地结实，切面多见血沫或液体（图3）；肺脏与胸腔明显粘连，胸腔有大量黄色、发出臭味的浑浊积液。肺门淋巴结肿大，切面呈紫红色；其他脏器组织病变不明显。
3 实验室诊断
3.1 培养基与试剂
8%绵羊鲜血琼脂培养基、伊红美蓝培养基（EMB）、SS琼脂培养基（SS）、甘露醇高盐培养基（MSA）、金黄色葡萄球菌显色培养基（BPAB）、卵黄琼脂培养基（EYAB）、哥伦比亚琼脂（CNA）、BETA-SSA琼脂培养基（SSA）等10种固体培养基，LIM液体培养基，支原体牛心汤复合培养基，配方为：牛心汤1 000 mL、蛋白胨10 g、氯化钠5 mL、酵母提取液10 mL、无菌马血清200 mL、1.25%醋酸铊溶液20 mL、青霉素200 IU/mL 。平皿固体培养基购自青岛海博生物技术有限公司；头孢噻呋钠、阿米卡星、四环素、氨苄西林、恩诺沙星、新霉素、卡那霉素、先锋霉素Ⅳ、先锋霉素Ⅵ、克百特、氧氟沙星、链霉素、庆大霉素等13种药物的药敏片购自杭州微生物试剂有限公司。结晶紫、碘液、95%无水乙醇、石碳酸复红；营养肉汤，革兰氏染色液，生理盐水，药敏纸片生化鉴定管等。
3.2 细菌的分离培养
无菌分别取2头病牛的肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结、气管、关节液等脏器组织新鲜切面分别接种到8%绵羊鲜血琼脂、EMB、SS、MSA、EYAB、CNA、SSA等固体培养基上，37 ℃18～24 h进行培养。其中在麦康凯培养基上呈现大量边缘整齐或波状、稍突起，表面光滑湿润，直径1.0～2.0 mm、粉红色或深红色的圆形菌落，在EMB培养基上呈紫黑色带金属光泽的圆形菌落[2]，在普通琼脂平板上呈灰白色，直径1.5～2.0 mm的圆形菌落。
3.3 支原体的分离培养
无菌采取肺、肝、脾、肾等组织脏器，直接剪成小块放在固体培养基上划一直线，再用无菌铂耳环在与其垂直方向划线[3]。固体琼脂平板置37 ℃潮湿需氧条件或在5%二氧化碳下培养48～96 h，用斜射光或放大25～40倍的立体显微镜检查，若有特异菌落出现，应选取散在的单个菌落用无菌解剖刀切下小琼脂块，用巴氏吸管小心地将菌落和周围琼脂吸入，再将其移入盛有2～3 mL的液体肉汤培养管培养48 h，将其培养物通过孔径0.45 μL的滤膜过滤后作1：10和1：100稀释，每一个稀释液取0.05 mL涂布于琼脂平板，即可得到纯的支原体培养物。
3.4 形态与染色镜检
挑取典型单个菌落进行革兰氏染色并逐一镜检，详细记录镜检结果。随后分2次对典型菌落进行了再次传代培养，获得了纯培养物。
3.5 生化鉴定
挑取典型菌落进行生化试验，观察并记录详细结果。
3.6 药敏试验
分别对2头发病牛各脏器组织分离培养的细菌培养物进行纸片式药敏试验，共选取13种常用及广谱抗菌药敏片进行检测。
4 结果与分析
4.1 镜检及生化试验结果
细菌涂片染色检查为革兰氏阴性、大小一致的粉红色的短小杆菌，初步鉴定为大肠杆菌。作生化试验对分离菌进行鉴定，结果表明符合大肠杆菌的特征（见表1）。
4.2 支原体培养结果
在高血清量的复杂培养基上有细菌生长，在固体培养基上菌落呈油煎荷包蛋样特征性外观[4]，结果见图4。
4.3 药敏试验结果
克百特、先锋VI高敏，氧氟沙星、诺氟沙星、头孢噻呋钠、四环素中敏，其他药物效果不明显（表2）。
5 小结与讨论
根据检测法确定了在成年母牛和犊牛的肺脏、肺门淋巴结、气管、关节液等组织中均检测到了支原体和致病性大肠杆菌。该牛场成年母牛和犊牛所发病例均为支原体、致病性大肠杆菌混合感染所致的传染性疾病。大肠杆菌和支原体都是条件性致病微生物。奶牛大肠杆菌性呼吸道炎症是由于母牛的饲养管理不良或在产后机体抵抗力下降的情况下，致病性大肠杆菌侵入机体而引起呼吸异常或呼吸困难，引发早产，同时病牛发生关节炎，表现为关节肿大或积液[6]。犊牛感染后表现为纤维素性肺炎或支气管肺炎[7]。支原体是我国奶牛和育肥牛新出现的一种致肺炎、继发关节炎的病原因子[8]。该病原体于1961 年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离出来[9]，1976 年被描述为致呼吸道疾病的病因[10]，目前在欧洲和北美洲流行并造成了严重的经济损失[11，12]。目前已被认为是育肥牛、青年奶牛与犊牛呼吸道疾病与多发性关节炎的重要病因。它不仅可以导致牛的急性呼吸系统疾病，还可以导致持续感染，以慢性支气管肺炎伴有肺干酪样或凝固性坏死病变为病理特征，常与细菌、病毒协同作用[13]。当牛场管理不善，如舍棚过度拥挤、通风不良、温度太高等气候因素将加剧病情，临床上对多种抗生素的治疗效果很差[14]。
综上所述，当致病性大肠杆菌和支原体混合感染引起奶牛肺炎及关节炎时，为牛群类似病例的有效治疗与防控带来困难。从降低相关病例的发病率、病死率及减少损失等角度考虑，建议采取综合性防控措施。如选择有效药物，最好是牛场先前并未使用但药效同样可靠的药用于群体的平时药物预防，配合有效的卫生消毒工作及良好的饲养管理如防寒保暖，以有效防止此类病例的发生与流行。对病牛做到早发现、早隔离、早治疗，尤其是要选择药敏试验推荐的有效药物，如克百特、先锋霉素Ⅵ进行治疗。
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