打开文本图片集
摘要：针对英山黄花菜（Hemerocallis citrina）叶部病害的病原菌进行形态特征观察、生物学特性研究、ITS序列分析以及室内药效试验。结果表明，该病原菌为Nigrospora sphaerica，菌丝生长适宜pH为5，最适的碳源是麦芽糖，最适的氮源是酵母浸出液；菌丝生长的致死温度是55 ℃；在供试的11种药剂中，以稀释500倍的50%多菌灵可湿性粉剂和稀释1 000倍的60%苯醚甲环唑水分散粒剂对病原菌的抑制效果最佳。根据病症，将该叶部病害命名为叶枯病。
关键词：黄花菜（Hemerocallis citrina）；叶枯病；病原菌鉴定；药效鉴定
中图分类号：S436.44 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）08-0051-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.013
Pathogen Identification and Screening Fungicides of Leaf Streak on Yingshan Daylily
ZHA Zhong-ping1，WAN Zheng-huang1，SU Xing2，JIAO Chun-hai3
（1.Food Crops Institute， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement， Wuhan 430064，China；2.Seed Management Bureau of Yingshan County，Yingshan 438700，Hubei，China；3.Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）
Abstract： The morphology，biological characteristics，rDNA internal transcribed spacer and screening of fungicides of leaf disease on Yingshan daylily（Hemerocallis citrina） were studied. The results showed that the pathogen was Nigrospora sphaerica.The optimun pH of mycelium growth was 5. The optimal C-source was maltose and the optimal N-source was yeast extract；The lethal temperature of mycelium growth was 55 ℃. According to screening results，prochloraz had the best inhibition on the mycelium growth of the pathogen among the nine tested fungicides. According to the symptom，the disease was named as leaf streak.
Key words： daylily（Hemerocallis citrina）； leaf streak； pathogen identification； screening fungicides
黃花菜（Hemerocallis citrina Baron），又名金针菜、萱草菜，为百合科萱草属多年生草本植物，是中国特色传统蔬菜之一。黄花菜富含多种糖类、蛋白质、维生素、无机盐及多种人体必需的氨基酸，其中胡萝卜素和维生素C含量是西红柿的5倍，具有抗菌消炎、清热利湿、明目安神、美容养颜等功效，同时，还具有较好的观赏价值和保持水土的作用[1]。英山黄花菜是湖北省英山县的地方品种，以条长肉厚、色泽黄亮、品质上乘、营养丰富而闻名。英山黄花菜主要种植区为英山县雷家店镇友谊村，自20世纪70年代开始，雷家店镇生产的黄花菜远销多个大中城市，是该镇农副产品中的“拳头”产品。近年来，黄花菜种植已成为友谊村农民脱贫致富的支柱产业，目前友谊村黄花菜种植面积20 hm2以上。5月“第三次全国农作物资源普查与收集行动”湖北调查二队在湖北省英山县雷家店镇友谊村调查，发现该村的黄花菜叶部病害发生严重，田间发病率为40%～80%，叶片感病多见于叶尖或叶缘，病斑褐色，后期病斑中间呈深褐色，斑斑相连成条斑，从叶尖向下扩展，使叶片局部枯死。该病每年发病早，3月上旬开始发病，不仅严重危害叶片，而且开花期花薹发病导致花薹枯死折断，造成整个花薹花蕾绝收，严重影响英山黄花菜的产量和品质。目前对该病害诊断及防治尚无据可依。本研究通过对英山县雷家店镇友谊村黄花菜叶部病害病原菌的形态、生物学特性和病菌的ITS序列分析，确定其种属地位，并筛选有效药剂，为该病害防治提供理论依据。现将试验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
利用组织分离法[2]从湖北省英山县雷家店镇友谊村黄花菜种植基地黄花菜叶片上分离、纯化、保存病菌。
1.2 病原菌形态观察和离体回接鉴定
将病菌菌块先置于马铃薯葡萄糖培养基（Potato dextrose agar，PDA）[2]平板中央，28 ℃黑暗培养3 d，观察菌落颜色和形态；并用无菌水洗下培养菌落中的分生孢子，在显微镜（XDS-500倒置显微镜）下观察其形态。
在湖北省农业科学院经济作物研究所蔬菜基地选取健康的黄花菜叶片，用自来水冲洗干净，用75%乙醇棉球轻擦表面。在无菌操作台上用镊子轻刮叶片表面，使其形成微创伤，然后用无菌打孔器打取5 mm菌饼置于创伤处，以接培养基的黄花菜叶片为对照。用无菌水打湿无菌纸后放入无菌瓷盘中，将处理好的叶片放在无菌纸上，用保鲜膜包裹瓷盘28 ℃培养。3次重复，每天观察并记录是否发病。
1.3 菌丝生长的致死温度和最适pH
取直径为0.9 cm菌块于1.5 mL离心管中，在不同温度梯度（30、35、40、45、50、55、60、65 ℃）下水浴10 min后接种于PDA平板。28 ℃培养，3 d后观察菌丝生长情况，3次重复。
取直径为0.9 cm菌块移到pH 4～11共9个梯度的PDA培养基平板上，平板置于28 ℃条件下培养3 d，测量菌落直径，3次重复。
1.4 不同碳源和氮源对菌丝生长的影响
基础培养基采用査彼（Czapek）培养基，硝酸钠2.00 g、氯化钾0.50 g、硫酸亚铁0.01 g、磷酸氢二钾1.00 g、硫酸镁0.50 g、蔗糖30.00 g、琼脂17.00 g。碳源用葡萄糖、D-果糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖和可溶性淀粉替代基础培养基中的碳源；氮源用甘氨酸、酵母浸出液、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、磷酸二氢铵、硝酸铵和L-谷氨酸钠替代基础培养基中的氮源。每个处理设置3次重复，28 ℃条件下接菌培养3 d后测量菌落直径。
1.5 核糖体基因转录间隔区ITS的PCR扩增和系统发育树构建
采用玻璃纸法培养真菌，28 ℃黑暗条件下PDA平板上培养48～72 h，收集菌丝，参照刘少华等[3]报道的尿素法提取菌丝DNA。用真菌特异引物对ITS1/ITS4扩增rDNA基因内转录间隔区（ITS，Internal transcribed spacer）[4]。碱基序列为ITS1（5′-TCC GTAGGTGAACCTGCGG-3′），ITS4（5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′）。PCR反应体系：10 mmol/L的dNTPs 2 μL，20 mmol/L的氯化镁2 μL，缓冲液2.5 μL，加10 μmol/L的引物ITS1和ITS4各0.5 μL， 2 U/μL的Taq酶1 μL，模板0.5 μL，用去离子水将反应体系补至25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性 3 min；95 ℃ 30 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环35次；72 ℃延伸10 min。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，检测到600 bp左右的条带，将PCR扩增产物回收，回收片段与克隆载体pGEM-T连接，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选，选取阳性菌落扩大培养后，部分菌液用M13（F/R：GTAAAACGACGGCCAG/CAGGAAACAG
CTATGAC）进行PCR扩增，凝胶电泳检测，并将检测后确认含有目的片段的阳性克隆送到华大基因测序公司测序。
将测得的基因序列在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行BLAST比较，ITS序列同源性较高的登记菌株作为参比菌株。用CLUSTALX 1.8软件对相似的序列进行多序列比对，由MEGA 5.0软件采用邻接法（Neighbor-joining）进行系统发育树构建和聚类分析，确定菌株在微生物系统发育学上的地位。
1.6 药剂抑菌试验
供试药剂和使用浓度参照供应商推荐的浓度，药剂均用无菌水配制。采用菌丝生长速率法[5]测定药剂的抑菌作用，以无菌水为对照，28 ℃恒温培养3 d，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制带宽度。每处理重复4次。
净生长量=菌落直径-菌餅直径
抑制带宽度=CK净生长量-处理净生长量
抑菌率=CK菌落直径-处理菌落直径/CK菌落直径×100%
2 结果与分析
2.1 病原菌形态与回接鉴定
病原菌在PDA培养基上生长速度较快，菌落近圆形，前期为白色，气生菌丝发达，后期变为灰白色至灰褐色。28 ℃条件下培养3 d后在显微镜下观察分生孢子，单胞，直径35 μm左右。病菌接种后2 d，叶片出现病斑，失绿黄化，随后病斑逐渐扩大；接种5 d，叶片出现典型的病症，病斑椭圆形，灰白色，病健交界处为灰褐色，具体见图1。
2.2 菌丝生长的最适pH
由图2可知，在pH 4、5、6、7、8、9、10、11条件下，菌落平均直径分别为7.20、7.62、6.95、7.33、6.05、6.30、5.47、3.68 cm。表明菌丝在pH 4～11条件下均能正常生长，生长的最适pH为5，菌丝在pH 11条件下生长速度显著慢于其他条件下的生长速度。
2.3 不同碳源和氮源对菌丝生长的影响
从图3可以看出，病菌对碳源的利用率高低表现为麦芽糖>蔗糖>葡萄糖>可溶性淀粉>甘露醇>D-果糖>α-乳糖，其中麦芽糖作为碳源，菌丝生长显著快于在其他碳源上的生长速度。从图4可以看出，病菌对氮源的利用率高低表现为酵母浸出液>蛋白胨>硝酸钾=L-谷氨酸钠=硝酸钠>硝酸铵>磷酸二氢铵>硫酸铵=甘氨酸，其中氮源为酵母浸出液时，菌丝生长显著高于其他氮源生长速度，氮源为甘氨酸或者硫酸铵时，菌丝的生长速度显著慢于除磷酸二氢铵外其他氮源菌丝的生长速度。
2.4 病原菌的致死温度
将菌块置于30、35、40、45、50、55、60、65 ℃水浴10 min，再培养，菌丝在30～50 ℃条件下处理均能正常生长，超过55 ℃病菌不能生长，确定菌丝的致死温度为55 ℃。
2.5 核糖体基因转录间隔区ITS的PCR序列与GenBank数据库比较分析
利用引物ITS1和ITS4对菌株进行PCR扩增，得到大小为515 bp的序列，把所得病菌序列提交至GenBank数据库（GenBank中的序列号：MF996488.1），利用Blast工具与GenBank数据库中已知微生物的ITS序列进行同源性比对。从图5可以看出，分离获得的菌株与Nigrospora sphaerica、Sordariomycetes sp.、Nigrospora chinensis和Nigrospora oryzae聚为一群，但与Nigrospora sphaerica位于同一分支。从分子角度进一步确定了该病菌为Nigrospora sphaerica。
2.6 不同杀菌剂的室内抑菌作用
由表1可知，稀释500倍的50%多菌灵可湿性粉剂与稀释1 000倍的60%苯醚甲环唑水分散粒剂对病原菌的抑制效果最佳，抑制带宽度最高，达到3.15 cm，而对照菌落直径为3.35 cm，抑制率达到94.03%。稀释800倍的50%氯溴异氰尿酸对病原菌没有抑制效果。在推荐浓度条件下，整体防效表现为多菌灵（苯醚甲环唑）>木霉菌>甲基硫菌灵>苯甲嘧菌酯>甲霜福美双>苯甲·丙环唑>代森锰锌>噁霉灵>三唑酮>氯溴异氰尿酸，多菌灵、苯醚甲环唑、木霉菌、甲基硫菌灵、苯甲嘧菌酯、甲霜福美双和苯甲·丙环唑对病原菌的抑制率均超过60%。
3 小结与讨论
英山黄花菜是湖北省英山县的地方特色品种，雷家店镇友谊村是英山黄花菜最大的生产基地。由于黄花菜是多年生草本植物，连续种植使雷家店镇的黄花菜叶部病害发病逐年加重，引起了当地政府和农民的高度重视，但由于缺乏该病害的诊断特征，因此对该病害的防治无据可依。英山黄花菜叶部病害由Nigrospora sphaerica引起，基于病症将该病害命名为黄花菜叶枯病。美国和日本均有Kabatiella microsticta引起的萱草叶枯病严重发生的报道[6-10]，中国园林工作者也在园林绿化基地发现K. microsticta引起的萱草叶枯病报道[11]。本研究的N. sphaerica是引起黄花菜叶枯病的一种新的致病菌，该病菌曾引起印度茶树叶枯病[12]。
英山黄花菜叶枯病病菌在pH 4～11均能生长，该病害的发生与土壤环境pH不相关，因此在雷家店的各田块都有该病害的发生。病菌致死温度为55 ℃，这与在英山县雷家店镇的黄花菜在3月中旬开始出土即可受到病害威胁，黄花菜的整个生长季节该病害都严重发生直接相关。病菌在不同成分的培养基上虽然均可生长，但在氮源为甘氨酸或者硫酸铵时，菌丝的生长显著被抑制。药效试验结果表明，病原菌对多菌灵、苯醚甲环唑、木霉菌、甲基硫菌灵敏感。上述研究結果将为英山黄花菜叶枯病病害发生规律及病害防治提供理论依据。
参考文献：
[1] 吴松海，郑家祯，赖正锋，等.闽南地区黄花菜生产概况及高产栽培技术[J].福建农业科技，2014（12）：33-34.
[2] 方中达.植物病理研究方法[M].北京：中国农业出版社，1979.
[3] 刘少华，陆金萍，朱瑞良，等.一种快速简便的植物病原真菌基因组DNA提取方法[J].植物病理学报，2005，35（4）：362-365.
[4] GARDES M，BRUNS T D. ITS primer with enhanced specificity for basidiomycetes：Application to the identification of mycorrhizae and rusts[J].Mol Ecol，1993，2（2）：113-118.
[5] 贾晓辉，傅俊范，周如军，等.草莓褐色轮斑病病原生物学研究及防治药剂的筛选[J].安徽农业科学，2005，33（10）：1849-1850.
[6] SPENCER J A. A new leaf-streak disease of Hemerocallis spp.[J].Plant Disease Reporter，1968，52：751-753.
[7] HERMANIDES-NIJHOF E J. Aureobasidium and allied genera[J].Studies in Mycology，1977，15：141-177.
[8] HOLCOMB G E. Daylily leaf-streak in Louisiana[J].Plant Disease Reporter，1976，60：232-233.
[9] LYONS R E. About daylilies[J].The Virginia Gardener Newsletter，1993，12：1.
[10] YOSHIKAWA M，YOKOYAMA T. Leaf blight of day lily caused by Aureobasidium microstictum（Bubák）W. B. Cooke[J].Annals of the Phytopathological Society of Japan，1987，53：606-615.
[11] 白庆荣，韩 双，赵 莹，等.萱草叶枯病菌生物学特性及对药剂敏感性研究[J].园艺学报，2013，40（12）：2513-2519.
[12] DUTTA J，GUPTA S，THAKUR D. First report of nigrospora leaf blight on tea caused by nigrospora sphaerica in India[J].Plant Disease，2015，99（3）：417.