宫粉羊蹄甲炭疽病病原鉴定及其药剂筛选

摘要:【目的】分离并鉴定引起宫粉羊蹄甲炭疽病的病原菌,筛选出适宜的防治药剂,为宫粉羊蹄甲炭疽病的识别和防治提供理论依据。【方法】采用组织块分离法分离宫粉羊蹄甲炭疽病的病原菌,通过针刺回接法确定其致病菌;采用形态学和分子生物学相结合的方法及柯赫氏法则对宫粉羊蹄甲炭疽病的病原菌进行鉴定;采用菌丝生长速率法测定9种不同杀菌剂对宫粉羊蹄甲炭疽病菌的室内毒力,根据抑制中浓度(EC50)选出抑制效果最好的杀菌剂。【结果】通过形态学观察和ITS序列分析,确定引起宫粉羊蹄甲炭疽病的病原为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides);不同杀菌剂对宫粉羊蹄甲炭疽病菌的抑制效果明显不同,其中98.4%多菌灵、98%溴菌腈和97%吡唑醚菌酯的抑制作用最强,EC50分别为0.071、0.083和0.095 mg/mL;97%嘧霉胺和81%氨基寡糖素的抑制作用较弱,EC50均大于4.000 mg/mL,而95%啶酰菌胺在高浓度时表现出微弱的抑制作用,低浓度时反而促进宫粉羊蹄甲炭疽病菌生长。【结论】引起宫粉羊蹄甲炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides);98.4%多菌灵、98%溴菌腈和97%吡唑醚菌酯对宫粉羊蹄甲炭疽病菌菌丝生长具有较强的抑制作用,可作为防治宫粉羊蹄甲炭疽病的化学杀菌剂使用。

关键词: 宫粉羊蹄甲;炭疽病;病原菌;药剂筛选

中图分类号: S763.7;S432.4 文献标志码:A 文章编号:2095-1191(2018)10-1975-07

0 引言

【研究意义】宫粉羊蹄甲(Bauhinia variegata Linn.)又称宫粉紫荆、洋紫荆、羊蹄甲等,苏木科(Caesalpiniaceae)羊蹄甲属(Bauhinia)半落叶乔木,是热带和亚热带地区重要的园林和绿化树种,在我国主要分布于福建、广东、广西和云南等地(Yatish et al., 2018)。近年来,随着广东省四大重点林业生态工程建设的不断推进及人们对观赏植物需求量的增加,羊蹄甲属植物在广东省的种植面积逐渐扩大,目前主要有宫粉羊蹄甲、红花羊蹄甲、羊蹄甲、白花洋紫荆和嘉氏羊蹄甲等。与羊蹄甲属的其他树种相比,宫粉羊蹄甲因其花色艳丽、香气诱人而深受广大市民的喜爱,在公园绿地上的应用也最广泛(唐洪辉等,2016;魏丹等,2017)。宫粉羊蹄甲为城市的美观和绿化做出了突出贡献,但单一树种的大面积种植也导致病害的发生日趋严重,对城市绿化及生态文明建设产生了严重的影响(冯皓等,2018)。因此,对于宫粉羊蹄甲病害的研究显得尤为重要。【前人研究进展】目前,关于宫粉羊蹄甲的研究主要集中在药用价值、花粉生活力和扦插育苗等方面,而针对宫粉羊蹄甲甚至羊蹄甲属植物病害的报道较少,主要有红花羊蹄甲的叶枯病、灰斑病、褐斑病、叶霉病及羊蹄甲的白粉病和炭疽病等(刘晓妹等,2013;李河等,2016;王晓阳,2016;冯皓等,2018)。宫粉羊蹄甲含有单宁、类黄酮、类固醇和生物碱等多种活性成分,具有驱虫、抗菌、抗肿瘤、消炎和保肝等多重药效,同时可用于治疗糖尿病、腹泻、消化不良和溃疡等多种疾病(Singh et al., 2016;Sowmya and Velraj, 2016;Khare et al., 2017)。在印度,宮粉羊蹄甲是传统的抗炎和治疗各种皮肤病的药物,茎外皮提取物在200 mg/kg时表现出较好的抗炎活性,优于对照和根皮提取物(Chirayath et al., 2015)。王裕霞等(2016)对宫粉羊蹄甲等5个羊蹄甲属树种花粉生活力进行测定,结果表明宫粉羊蹄甲花粉萌发率最高,可作为杂交育种较理想的花粉来源。在广州地区,宫粉羊蹄甲在秋季进行扦插育苗效果较好,成活率达70.00%;最适生长调节剂为吲哚丁酸(IBA),在浓度为100 mg/L时成活率最高;基质为蛭石的成活率最高,达66.67%(魏丹等, 2016)。【本研究切入点】笔者在调查中发现,宫粉羊蹄甲有疑似炭疽病发生,且对叶片造成一定的危害。炭疽菌属真菌种类繁多,寄主广泛,宫粉羊蹄甲是否为新的寄主值得进一步研究。【拟解决的关键问题】以宫粉羊蹄甲为研究对象,采集疑似炭疽病发病组织,采用组织块分离法分离病原菌,通过形态学和分子生物学相结合的方法及柯赫氏法则鉴定其病原菌,同时采用菌丝生长速率法测定不同杀菌剂对宫粉羊蹄甲病原菌的室内毒力,旨在为宫粉羊蹄甲病害的识别、鉴定及病害综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试植物材料:宫粉羊蹄甲疑似炭疽病的叶片和健康叶片均采自华南农业大学校园。供试杀菌剂(均为原药):98%嘧菌酯、95%啶酰菌胺、96.8%苯醚甲环唑、97%嘧霉胺、97%吡唑醚菌酯、98%溴菌腈、81%氨基寡糖素、98%福美双和98.4%多菌灵,均购自中国农业科学院植物保护研究所廊坊农药厂。

主要试剂:Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、通用引物ITS4和ITS5[生工生物工程(上海)股份有限公司];升汞和二甲基亚砜(DMSO)(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司)等。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):葡萄糖20 g,马铃薯200 g,琼脂20 g,加去离子水定容至1000 mL,分装后121 ºC湿热灭菌20 min,冷却后备用。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 病害症状观察及描述 使用放大镜观察病叶,对病斑进行描述并记录,如病斑的位置、大小、颜色、排列等;对病害植株的生长状态进行观察和描述。

1. 2. 2 病原菌分离和纯化 参照陈哲等(2018)、席中刚等(2018)的方法分离病原菌,略有修改。先将发病的叶片用水冲洗后置于超净工作台上,剪取发病叶片病健交界处组织10份,大小约3 mm×3 mm,置于75%酒精中浸泡20 s,再放入0.1%升汞溶液中浸泡1 min,然后用无菌水冲洗3~4次,用灭菌滤纸吸干表面水分,接种于准备好的PDA培养基上,而后放入28 ºC恒温培养箱中培养,待菌丝长出后,用无菌牙签挑取菌落边缘生长旺盛的菌丝接种到另一个PDA培养基上。重复以上操作3次左右,获得纯化的菌株,然后将纯化后的菌株接种于装有PDA斜面培养基的5 mL冻存管上,于4 ºC保存备用。