摘 要 核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）是桑葚白果病的主要病原菌之一，为害桑葚引起“白果病”。本文研究了哈茨木霉菌与世高单剂及混合物防治核地杖菌的潜力。研究结果表明：哈茨木霉的乙醇提取物（毒素）对核地杖菌菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为70%和80%以上，在室内条件下哈茨木霉毒素与世高对核地杖菌菌丝生长抑制的EC50分别为5.97、19.73 μg/mL。哈茨木霉与世高混合物对核地杖菌的抑制效果与混合物中两种单剂的含量有关，混合物T3（3.0+7.0）， T5（6.0+7.0） 和 T6（6.0+14.0）处理组对核地杖菌的抑制效果表现为增效作用；从对病原菌的抑制效果、使用成本与化学农药使用量等方面考虑，混合物T5是用于防治核地杖菌的最佳组合。本研究结果可为使用哈茨木霉毒素及其与世高联合防治桑葚白果病提供参考。
关键词 哈茨木霉；核地杖菌；世高；生物测定；孢子萌发抑制；菌丝生长抑制
中图分类号 S476 文献标识码 A
Abstract Scleromitrula shiraiana is one of the fungal pathogen that attacks mulberry fruits and causes disease named as “popcorn disease”. Trichoderma harzianum was evaluated for its efficiency to suppress plant pathogen S. shiraiana alone or combined with fungicide difenoconazole under laboratory conditions. The results showed that the ethanol extracts of T. harzianum caused high mycelial growth inhibition and germination inhibition of S. shiraiana， with the inhibition value up to 70% and 80%， respectively. The EC50 of the ethanol extracts of T. harzianum or difenoconazole in mycelial growth inhibition of S. shiraiana was 5.97 μg/mL or 19.73 μg/mL under laboratory condition， respectiviely. The level of synergism between the ethanol extract and difenoconazole was affected by the concentration of each component in the mixtures. The synergistic effects were observed in treatments T3（3.0+7.0）， T5（6.0+7.0） and T6（6.0+14.0）， respectively. The treatment T5（6.0+7.0） was determined as the best additive effects according to the inhibition， Me and Chi-square values， also the cost and reduce use of fungicides. The current research on the joint action of the ethanol extracts from T. harzianum with difenoconazole offered a promising， safe and effective alternative to fungicides in treatment against S. shiraiana， popcorn disease of mulberry.
Key words Trichoderma harzianum； Scleromitrula shiraiana； difenoconazole； bioassay； mycelial growth inhibition； germination inhibition
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.024
桑椹白果病是桑椹菌核病的俗稱，又称桑白果病，属真菌类病害，是桑果上的主要病害，其病原菌主要有6种：桑实杯盘菌（Ciboria shiraiana）、肉阜状杯盘菌（Ciboria carunculoides）、核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、聚杯盘菌（Synciboria ningpoensis）、茜草生核地杖菌（Scleromitrula rubicola）[1-5]。核地杖菌等白果病病原菌主要侵染桑树的花，或在叶片的表面存活一段时间，但极少能侵染桑树的叶片和
茎[3-4]。白果病病原菌的孢子附着到桑椹的花器上，随后萌发、侵入子房内，入侵的菌丝在未成熟的桑果中迅速生长、大量增殖，最后菌丝在桑果中形成菌核，导致桑果呈白色、俗称“白果”。桑椹白果病在世界各地均有分布，我国的广东、浙江、江苏、安徽、上海、陕西等地均有该病发生为害的报道[1-2]。桑椹白果病轻则影响桑葚的产量与品质，重则致使桑果无法正常成熟收获，导致桑葚大面积减产，甚至颗粒无收，带病菌和农药残留的桑叶又严重威胁蚕茧的生产，直接影响桑椹加工产业与蚕业生产所需的原料来源，威胁到桑果产业的持续发展。桑椹白果病的防治目前主要采用农业综合防治和化学防治。国内外多年的田间实践表明，化学农药不能持续有效地控制白果病的大面积爆发危害[6-7]，同时会导致蚕桑产品的农药残留。开展桑椹白果病的生物防治有利于保护蚕桑产业的原料和产地的生态环境，采用以微生物源农药等为主的生物防治措施能持续、有效地控制白果病的发生为害。
木霉菌（Trichoderma sp.）广泛存在于不同类型的土壤中，是一种重要的植物病原生防真菌，其中哈茨木霉菌（T. harzianum）是白绢病、立枯病、疫病等多种植物病原菌的寄生菌和拮抗菌[8-9]。哈茨木霉菌主要通过重寄生作用、抗生作用、营养和空间的竞争、诱导植物产生抗性等多种方式来抑制植物病原真菌的为害[9-11]。哈茨木霉分泌的次生代谢产物可通过有效地破坏病原菌的细胞膜、使病原菌的原生质浓缩等抑制病原菌生长[11-13]。次级代谢产物中的小分子量、易挥发性非极性物质，如简单的芳香族化合物、丁烯酸内酯类和吡喃酮类聚酮化合物、挥发性的萜烯类、异腈等能在土壤中移动，可有效抑制土壤中的病原菌；另一类大分子、高分子量的极性物质，如木霉素（trichodermin）、peptaibols物质等[13-14]对白绢病、立枯病等有较强的抑制作用，其中木霉素对水稻纹枯病菌（Thanatephorus cucmeris）和黄瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）菌丝生长有显著的抑制作用[15-16]。尽管有关哈茨木霉菌代谢产物的杀菌机制及利用代谢产物防治水稻等作物病害方面已有研究报道，但利用哈茨木霉毒素防治桑椹白果病方面的研究未见报道。
在前期研究哈茨木霉毒素的过程中发现，该毒素能有效地抑制白果病病原菌的生长。因此，本研究主要评估哈茨木霉粗毒素及其与世高混合物对核地杖菌的孢子萌发、菌丝生长的抑制作用，为利用哈茨木霉菌及其代谢产物防治桑葚白果病提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株和试剂 供试菌株为哈茨木霉菌（T. harzianum）菌株Th-N5（保藏号为CCTCC No：M2016251），分离于广州地区被自然侵染的桑葚白果上。核地杖菌（S. shiraiana）Ss-05菌株分离于广州地区被自然侵染的桑葚白果上，保藏于华南农业大学农学院昆虫病原真菌实验室。核地杖菌的鉴定参考White等[17]的方法，以基因组DNA为模板用ITS1/ITS4为引物（引物序列为5’-TCCGTAGGGTGAACCTGCGG-3’ / 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）扩增其特异的ITS序列，在GenBank中比对序列以鉴定菌株。哈茨木霉菌和核地杖菌均在PDA培养基上分别于（26±1）、（20±1）℃培养，待产孢后用0.1%的吐温-80水溶液洗下孢子，用血球计数板将孢子液浓度分别调整到1×106、1×103个孢子/mL的备用。
试验所用的世高为市售的苯醚甲环唑原药（先正达投资有限公司生产）。
1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，加蒸馏水至1 000 mL。
固体发酵培养基： 麸皮 ： 玉米粉 = 3.5 ： 1（w/w），蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾1.0%，硫酸铵2.0%，硫酸镁1.0%，氯化钙0.5%。
1.2 方法
1.2.1 哈茨木霉毒素的提取 将配制好的固体发酵培养基加水拌匀后装入三角瓶，在121 ℃下灭菌 30 min，冷却后每瓶接种 l～3 mL孢子液，（25±1）℃恒温培养 4 d后向固体发酵产物中分别加入石油醚、乙酸乙酯、甲醇和乙醇等4种有机溶剂，超声波处理 30 min，浸泡 2 d后过滤，获得分别由4种有机溶剂萃取的提取物（真菌毒素），将提取物减压浓缩获得哈茨木霉毒素。
1.2.2 哈茨木霉毒素抑制核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的生物测定 向PDA培养基中分别加入1.2.1中经4种有机溶剂提取的哈茨木霉毒素，制备成毒素浓度为10 µg/mL的PDA固体平板培养基；将浓度为1×103个孢子/mL的核地杖菌孢子悬浮液30 µL涂布于含毒素的PDA平板上，以不含粗毒素的PDA平板为对照，在20 ℃培养并观察产生的菌落，记录固体平板上的菌落数。每个处理各20个平板，每个处理3次重复。孢子萌发抑制率=[（对照区的菌落数 - 毒素处理区的菌落数） /对照区的菌落数] ×100%。将乙醇提取的毒素加入PDA培養基中配制成浓度为1.5、3、6、12、24 µg/mL的固体平板，取30 µL浓度为1×103孢子/mL的核地杖菌孢子悬浮液涂布于含不同浓度毒素的PDA平板上，在20 ℃培养、观察平板上的菌落，以不含毒素的PDA平板为对照，每日定时记录平板上长出的菌落数。每个处理3次重复。研究中所用核地杖菌孢子在不含毒素条件下的孢子萌发率均高于93%。
将核地杖菌的孢子悬浮液涂布于PDA平板上，在20 ℃培养至产生菌丝，选取菌丝生长均匀的地方打孔获得菌丝块（ø 5 mm）。将乙醇提取的毒素加入PDA培养基中配制成浓度为1.5、3、6、12、24 µg/mL的固体平板，在平板中央接入核地杖菌的菌丝块，以不含毒素的PDA平板为对照，在20 ℃培养。采用十字交叉法，每天定时测量菌落的直径。每个处理重复3次。菌丝生长抑制率= [（对照区菌落直径-处理区的菌落直径）/对照区菌落半径] ×100%。
1.2.3 世高抑制核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的生物测定 将世高加入PDA培养基中配制成浓度为3、6、12、24、48 µg/mL的固体平板，采用1.2.2的方法测定世高对核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的抑制率，每个处理重复3次。
1.2.4 哈茨木霉毒素与世高的混合物抑制核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的生物测定 根据前面的测定结果，将哈茨木霉毒素与世高按不同比例混合，哈茨木霉毒素（乙醇提取物，µg/mL）与世高（µg/mL）的终浓度分别为T1（3+0） 、T2（6+0） 、T3（3+7） 、T4（3+14）、T5（6+7） 、T6（ 6+14）、T7 （0+7）、T8（0+14）。再将混合物加入PDA培养基中配制成固体平板，采用1.2.2 的方法测定不同浓度的混合物对核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的抑制率，每个处理重复3次。
1.3 数据处理与分析
孢子萌发和菌丝生长抑制率采用多重比较分析法中的Tukey’s HSD检验（α=0.05）；EC50的计算方法采用机率分析法（浓度对数-概率线（LC-p））和X2检验，EC50值及其95%置信限通过SPSS 17.0软件系统计算分析。毒素与世高混合物联合作用的理论抑制率采用如下公式计算[18]：
Me=Ma+Mb×（1-Ma），
X2=[（Mab-Me）×100]×[（Mab-Me）×100]/（Me×100）。
其中，抑制率百分数要求转换成比率值（如0～100%转换为0～1）[19]，公式中的Me表示混合物联合作用的理论抑制率，Ma、Mb、Mab分别表示哈茨木霉毒素、世高、两者混合物的实际抑制率。如果Mab显著小于Me则两者在混合物中表现为拮抗作用，Mab显著大于Me则两者在混合物中表现为增效作用，否则，两者在混合物中表现为加和作用。
2 结果与分析
2.1 哈茨木霉毒素抑制核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的生物测定
以核地杖菌为生物测定对象，测定了石油醚、乙酸乙酯、甲醇和乙醇等有机溶剂提取毒素的抑菌活性，结果见图1，除甲醇和乙醇两种有机溶剂提取物对核地杖菌孢子萌发的抑制率差异不显著外，其它溶剂提取物对核地杖菌的抑菌活性差异显著。甲醇提取物（10 µg/mL）对核地杖菌孢子萌发的抑制率最高，高达75%以上，石油醚提取物（10 µg/mL）的抑菌活性最低，为23.1%。甲醇和乙醇为提取哈茨木霉菌固体发酵产物中毒素的最佳溶剂。但甲醇的沸点低（64.7 ℃）、易挥发，对人体有一定的毒性，同时在操作过程中溶剂因挥发而损耗较大，所以本研究选用乙醇作为提取毒素的溶剂。
哈茨木霉发酵产物的乙醇提取物（哈茨木霉毒素）对核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的影响见表1。随着毒素浓度的增加，毒素对核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用增强。当浓度为12 µg/mL时，毒素对核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的抑制率均高达70%以上。浓度为12 、24 µg/mL的毒素对孢子萌发和菌丝生长的抑制率差异不显著，其它浓度的毒素对孢子萌发和菌丝生长的抑制率差异显著。培养48 h，毒素对核地杖菌孢子萌发抑制率的EC50为3.89 µg/mL；培养7 d，毒素对核地杖菌菌丝生长抑制率的EC50为5.97 µg/mL。
2.2 世高抑制核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的生物测定
经不同浓度的世高处理后，核地杖菌的孢子萌发率和菌丝生长抑制率见表2。随着世高浓度的增加，世高对核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用增强；当浓度为24 µg/mL时，世高对核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的抑制率高达55%以上。世高对核地杖菌孢子萌发抑制率的EC50为13.2 µg/mL，对核地杖菌菌丝生长抑制率的EC50为19.73 µg/mL。
2.3 哈茨木霉毒素与世高对核地杖菌的联合作用
在前面测定哈茨木霉毒素、世高抑制核地杖菌的孢子萌发和菌丝生长的EC50值的基础上，筛选两种单剂混合后可有效抑制核地杖菌的最佳浓度。哈茨木霉毒素和世高及其混合物对核地杖菌的抑制率见表3。毒素与世高的混合物与其对应单剂对核地杖菌的抑制率差异显著，混合物T5和T6对核地杖菌的抑制率差异不显著。在所有处理中，混合物T6对核地杖菌的抑制率最高，对孢子萌发的抑制率高达92%、对菌丝生长抑制率高达89%。比较混合物对核地杖菌的实际抑制率与理论抑制率，除混合物T4表现为拮抗作用外，其它混合物均表现为增效作用。综合比较混合物对核地杖菌的防治效果与药剂的成本、化学农药的使用量，T5组合是最佳混合物浓度，在防治效果高达90%的情况下减少了化学农药世高的使用量。
3 讨论
哈茨木霉菌是一种重要的生防真菌，除了通过菌丝重寄生直接破坏病原菌的菌丝、争夺营养抑制病原菌生长外，其分泌的代谢产物中含有的多种毒素能有效地抑制病原菌生长。本研究中哈茨木霉毒素对核地杖菌的孢子萌发与菌丝生长的抑制率高达70%以上。与此相似，哈茨木霉菌分泌的Alamethicin F-50、Alamethicin II、Atroviridin B及Atroviridin C等4种peptaibols抗菌肽对水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani AG4、黄瓜立枯病菌R. solani、黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum、西瓜枯萎病菌F. oxysporum f. sp. niveum、水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae等5种病原菌的孢子萌发和菌丝生长均有较强的抑制作用[16]。这主要是因为哈茨木霉菌分泌的毒素中含許多能抑制病原菌生长的物质，如：Trichokindins I-X、Trichorzin HA I-VII、Harzianins、Trichorzin PA II-VII、Trichorozin I-VII、Alamethicin F-50、Alamethicin II、Atroviridin B等多达57种peptaibols抗菌肽类物质[20]和木霉素（trichodermin）等毒素；peptaibol抗菌肽能选择性地结合于细胞膜形成跨膜孔道，破坏细胞膜的完整性，引起其胞内物质外流而导致细胞死亡[21-22]，木霉素则主要作用于细胞内相关蛋白质的合成而影响病原菌的生长。因哈茨木霉菌代谢产物中的活性成分种类众多，本研究从不同的有机溶剂中筛选出甲醇和乙醇为提取哈茨木霉菌毒素的最佳溶剂，但甲醇的沸点低（64.7 ℃）、易挥发，对人体有一定的毒性，同时在操作过程中溶剂因挥发而损耗较大，所以本研究选用乙醇作为提取毒素的溶剂。
桑葚白果病病原菌在桑葚开花期侵染花，随后菌丝在子房、果实中生长，最后导致桑果出现白果，病原菌极少侵染桑葚的叶片和枝条[3-4]。因而白果病的防治重点是保护桑葚开花期的花免受病原菌的侵染，或在花被侵染的早期杀灭入侵的菌丝。尽管防治桑葚白果病的化学农药较多，但多菌灵、菌核净等常用的内吸性化学农药因长期大量的使用导致白果病病原菌产生了较强的抗药性[6-7]；世高为低毒内吸性杀菌剂，渗透作用强、有向上传导的功能，可在新生的幼叶、花等部位积聚，有助于防治花器上的病害；同时哈茨木霉毒素的成分复杂，目前有关其作用机制方面的研究不够深入，所以我们选择了具有内吸作用的高效低毒化学农药世高与哈茨木霉毒素混合使用，希望能在花被侵染的早期利用世高清除入侵的病原菌菌丝，以提高对白果病的防治效果。本研究中哈茨木霉毒素与世高的混合物对核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的抑制率高于单剂对核地杖菌的抑制率，同时混合物对核地杖菌的防治效果表现为增效作用，这样使用低剂量的化学农药世高与真菌毒素混合取得高达80%的抑制效果，减少了化学农药的使用量。
参考文献
[1] 胡君欢，蔡岳兴，周书军，等. 宁波桑果基地菌核病菌的多样性与ITS初步分析[J]. 宁波大学学报（理工版），2011， 24（3）：20-23.
[2] 王国良. 桑椹菌核病菌多样性调查[J]. 菌物研究，2009，7（Z1）：189-192.
[3] Ye M，Yue H，Luo G Q，et al. Effect of a fungal pathogen， Trichoderma hamatum， on growth and germination of Ciboria carunculoides under laboratory conditions. Pakistan Journal of Zoology， 2014，46（5）：1377-1384.
[4] Ye M，Kuang Z，Zhao X，et al. Screening of fungicide to control Ciboria carunculoides under laboratory conditions[J]. Pakistan Journal of Zoology，2014，46（1）：53-59.
[5] Lǚ Z，Kang X，Xiang Z，et al. A laccase gene Sh-lac is involved in the growth and melanin biosynthesis of Scleromitrula shiraiana[J]. Phytopathology， 2016， 107（3）：353-361.
[6] Wang Y，Hou Y P，Chen C J，，et al. Detection of resistance in Sclerotinia sclerotiorum to carbendazim and dimethachlon in Jiangsu Province of China[J]. Australasian Plant Pathology ，2014，43（3）：307-312.
[7] Zhu A Q，Zhou F，Li J L， et al. Carbendazium resistance in field isolates of Scerotinia sclerotiorum in China and its management[J]. Crop Protection，2016，81：115-121.
[8] 郭潤芳，刘小光. 拮抗木霉菌在生物防治中的应用研究进展[J]. 中国生物防治，2002，18（4）：180-184.
[9] Harman GE. Myths and Dogmas of biocontrol changes in perceptions berived from research on Trichodermin harzianum T-22[J]. Plant Disease，2007，84（4）：377-393.
[10] Harman G E， Howell C R， Viterbo A， et al. Trichoderma species-opportunistic， avirulent plant symbionts[J]. Nature Reviews Microbiology， 2004， 2（1）：43-56.
[11] Schuster A，Schmoll M. Biology and biotechnology of Trichoderma[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87（3）：787-799.
[12] Cardoza R E H M， Vizcaino J A， Sanz L， et al. Secondary metabolites produced by Trichoderma and their importance in the biocontrol process. [M]// Mellado-Dura´n E， Barredo JL （eds） Microorganisms for industrial enzymes and biocontrol. Research Signpost， 2005： 207.
[13] Reino J L， Guerrero R F， Hernández-Galán R， et al. Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma[J]. Phytochemistry Reviews， 2008， 7（1）：89-123.
[14] Thrane U，Poulsen S B，Nirenberg H I，et al. Identification of Trichoderma strains by image analysis of HPLC chromatograms[J]. FEMS microbiology letters，2001，203（2）：249-255.
[15] 石一珺，申屠旭萍，俞晓平. 1 株枸骨内生真菌菌株的分类鉴定及其代谢产物的生防作用研究[J]. 植物病理学报，2009，39（4）：362-367.
[16] 潘 顺，刘 雷，王为民. 哈茨木霉发酵液中peptailbols抗菌肽的鉴定及活性研究[J]. 中国生物防治学报，2012，28（4）：528-536.
[17] White T J， Bruns T D， Lee S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]// Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al. PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications. San Diego， CA， USA： Academic Press，1990：315-322.
[18] Xu D，Ali S，Huang Z，et al. Insecticidal activity influence of 20-Hydroxyecdysone on the pathogenicity of Isaria fumosorosea against Plutella xylostella[J]. Biological Control，2011，56（3）：239-244.
[19] Abbott W S. A method for computing the effectiveness of an insecticide[J]. Journal of Economic Entomology， 1925， 18： 265-267.
[20] Peptaibol Database[EwB/OL]. http：//peptaibol.cryst.bbk.ac.uk/home.shtmL.
[21] Degenkolb T， Kirschbaum J， Bruckner H. New sequences， constituents， and producers of peptaibiotics： an updated review[J]. Chemistry & Biodiversity，2007，4（6）：1 052-1 067.
[22] Chugh J K，Wallace B A. Peptaibols：models for ion channels[J]. Biochemical Society Transactions，2001，29（4）：565-570.