摘要：2017年在青岛市城阳区、李沧区多个花卉市场调查发现，观赏凤梨叶斑病发病率高达30%～50%。采集观赏凤梨叶斑病病叶，对病原菌进行分离，采用形态学与分子生物学方法对病原菌进行鉴定，并通过致病试验进行验证。结果表明：引起青岛地区观赏凤梨叶斑病的病原菌为链格孢菌（Alternaria alternata）。本研究首次报道链格孢菌引起观赏凤梨叶斑病，对该病害的防治具有重要意义。
关键词：观赏凤梨叶斑病；链格孢菌；形态特征；分子鉴定；致病试验
中图分类号：S668.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）11-0116-04
Abstract The ornamental pineapple leaf spot occurred seriously in several flower markets in Qingdao in 2017 with the disease rate up to 30%～50%. The pathogens were isolated from the infected leaves of ornamental pineapple leaf spot and then identified by morphological and molecular biology methods and verified by pathogenicity test. It showed that the ornamental pineapple leaf spot was caused by Alternaria alternata. This was the first report of ornamental pineapple leaf spot caused by A.alternata in China， and it is of great significance for the prevention and control of the disease.
Keywords Ornamental pineapple leaf spot； Alternaria alternata； Morphological characteristics； Molecular identification； Pathogenicity test
觀赏凤梨（Ornativa pineapple）属凤梨科（Bromeliaceae），原产于中、南美洲的热带、亚热带地区，于20世纪80年代传入中国，是国内外广受欢迎的室内常绿观赏花卉植物。观赏凤梨除具有观赏价值外，还具有吸收污染物的特性，可用作空气污染指示植物[1]。
观赏凤梨叶斑病造成叶片产生椭圆形或不规则形病斑，中央灰褐色，边缘深褐色，有水渍状黄色圈，病斑引起叶片局部皱缩，严重可致叶片干枯，使植株生长受阻。国内外有关观赏凤梨叶斑病的报道中，曾莉等[2]鉴定了筒凤梨拟茎点霉（Phomopsis spectabilis V. G. Rao & B. R. D. Yadav）、可可球二孢菌（Botryodiplodia theobromae Pat.）、凤梨顶多毛孢菌（Bartalinia ananassa L. Zeng， Z. D. Jiang et P. K. Chi）、油球拟茎点霉[Phomopsis diplodinoides （Sacc.） Punith.]等8种引起观赏凤梨叶斑病的病原菌。冯淑杰等[3]报道了观赏凤梨叶斑病的病原菌为炭疽菌（Colletotrichum sp.）和弯孢霉（Curvularia sp.），两者单独侵染或复合侵染都可引起叶斑病的发生。2014年，在福建省首次报道弯孢霉（Curvularia clavata）侵染凤梨（Ananas comosus）叶片引起叶斑病[4]。2017年，观赏凤梨叶斑病在青岛市城阳区、李沧区多个花卉市场普遍发生。为了明晰青岛地区观赏凤梨叶斑病病原菌，为病害的防控提供理论依据，本研究结合病原形态学和分子生物学方法对病原菌进行鉴定，并通过致病性试验进行验证。在国内外首次发现链格孢菌可引起观赏凤梨叶斑病，为观赏凤梨病害的防治提供了新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 病样采集及病原物的分离
2017年9月，在青岛市城阳区、李沧区的花卉市场采集观赏凤梨叶斑病病叶，采用常规组织分离法进行病原物的分离培养。
1.2 病原菌形态学观察
将分离的病原菌接种于PDA培养基上，25℃培养箱中培养7 d后观察菌落的形态特征。同时从培养皿中挑取少量菌丝及孢子，放在滴有无菌水的载玻片上制成临时玻片，在显微镜（Olympus BX53）下观察菌丝、分生孢子及分生孢子梗的形态特征，并测量大小。
1.3 病原菌的分子生物学鉴定
采用CTAB法提取病原菌基因组DNA[5]。用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′）进行PCR扩增[6]，利用另一对引物H3-1a（5′-ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG-3′）和H3-1b（5′-GCGGGCGAGCT GGATGTCCTT-3′）对cds histone 保守基因进行扩增 [7]。PCR反应体系均为20 μL，反应液为：2 × TSINGKE Master Mix 10 μL，引物（ITS1/ITS4或H3-1a/H3-1b）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR扩增程序：95℃ 5 min；95℃ 40 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 10 min。在质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上进行检测，产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，并进行BLAST同源性对比。
1.4 致病性测定试验
1.4.1 孢子悬浮液接种 将待接种健康观赏凤梨叶部组织用无菌水清洗干净，70%乙醇消毒。将孢子悬浮液浓度控制在1×105～1×107个/mL。取20 μL分生孢子悬浮液分别滴至人工刺伤及无刺伤的健康叶片上，以无菌水作为对照，设3次重复，接种后室温下保湿培养，每隔24 h观察并记录发病情况。
1.4.2 菌饼接种 取PDA培养基上培养7 d的病原菌菌饼分别接种在人工刺伤及无刺伤健康叶片上。以空白PDA块作为对照，设3次重复，接种后室温下保湿培养，每隔24 h观察并记录发病情况。
2 结果与分析
2.1 观赏凤梨叶斑病的症状及病原物形态特征
2.1.1 观赏凤梨叶斑病症状 叶斑病只侵染观赏凤梨叶片，未发现侵染花序的现象。发病初期，叶片边缘出现小的褪绿斑，随后褪绿部分逐渐变褐，并向叶片内部逐渐扩展为椭圆形或不规则形病斑，有黄色晕圈。病害发展后期，病斑边缘颜色加深为黑褐色，造成叶片局部卷曲，影响植株的正常生长（图1A）。
2.1.2 病原菌形态特征 将保存的菌株接种于PDA培养基（9 cm×9 cm）后，菌落铺展近圆形，气生菌丝初为白色，后逐渐变为灰褐色 （图1B）。菌丝无色透明，分生孢子梗淡褐至褐色，以合轴式延伸。分生孢子顶端无喙或有喙，单生或串生，倒棍棒形、椭圆形或卵圆形，大小为（19.9～44.0） μm×（7.2～16.5） μm，具橫膈膜2～6个，1～5个纵、斜隔膜，分隔处略缢缩。短喙柱状或锥状，大小为（0～16.2） μm×（2.1～4.5） μm（图1C和D）。
2.2 病原菌分子生物学鉴定结果
对观赏凤梨叶斑病病原菌基因组DNA进行PCR扩增后，得到长度为544 bp的rDNA-ITS序列（Accession No. KY307851）（图2A）。将该序列在GenBank中进行同源性分析比较，BLAST比对结果表明，该菌株的rDNA-ITS序列与已报道的A. alternata（KY307851、KJ008698、KR709045等）和A. tenuissima（KF919124、JF802103、KF887098等）的同源性均达99%以上。通过对菌株cds histone保守基因序列进行扩增（图2B）并比对，与已报道的链格孢菌株A. alternata（KF997064、KF308951、AF404593等）的同源性均达到99%，最终确定该菌株为链格孢菌。
2.3 致病性试验结果
用孢子悬浮液（浓度为4.5×105个/mL）接种，无论自然条件还是刺伤接种均未发病（图略）。用菌饼接种，自然条件下未发病，刺伤条件接种48 h后发病症状明显（图3）。
3 讨论与结论
叶斑病是观赏凤梨的主要病害之一，在广东等地区均有报道[2]，随着观赏凤梨在北方地区的流行，观赏凤梨叶斑病有逐渐加重的趋势。本研究于2017年9月在青岛多地花卉市场进行调查发现观赏凤梨叶斑病发生普遍，随即开展了病原菌的分离、鉴定工作，并根据柯赫氏法则进行致病试验验证，最终确定该病原菌为链格孢菌，此为国内外首次报道由A. alternata引起观赏凤梨叶斑病。
链格孢属（Alternata）真菌种类繁多，一些小孢子链格孢广泛存在于自然界中，腐生于植物残体及其它物质中，而一些大孢子链格孢能侵染活体植物叶片，造成叶斑病[7]。链格孢菌寄主广泛，可以危害十字花科、茄科等多种蔬菜，也可造成烟草赤星病、苹果斑点落叶病等病害。在本研究的致病试验中，自然无伤接种条件下观赏凤梨叶片未出现发病现象，但在有伤口菌饼接种条件下保湿48 h后出现明显的发病症状，证明链格孢菌为观赏凤梨的一种弱致病菌，可以从伤口侵染植株造成叶斑病。因此在观赏凤梨的栽培生产和搬运过程中，应该注意保护植株叶片防止造成伤口，以此切断病原菌侵染途径，达到防治观赏凤梨叶斑病的目的，从而提高观赏凤梨的观赏价值。
参 考 文 献：
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