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摘要： 为了明确Cg CDA3基因在胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）生长及侵染致病过程中的功能，从G.gloeosporioides基因组中克隆Cg CDA3基因，首先进行生物信息学分析，然后利用基因同源重组的方法获得CgC-DA3基因缺失突变体（△cda3），最后分析了△cda3的孢子萌发、附着胞形成和侵染致病性变化。结果表明，CgC-DA3基因ORF全长1470 bp，编码含489个氨基酸的蛋白质，其含有一个聚多糖去乙酰化酶保守结构域。CgCDA3蛋白与已知的西瓜炭疽菌（C.orbiculare）、禾生炭疽菌（C.graminicda）和睡莲炭疽菌（C.nymphaeae）的CDA蛋白同源性较高，同源性分别为63%、60%和80%。Cg CDA3基因缺失突变体同野生型相比，生长及产孢正常，但表现为孢子萌发能力下降，附着胞形成率降低，同时侵染芒果的致病性也显著减弱。推测Cg CDA3基因参与调控胶孢炭疽菌孢子萌发和附着胞形成等形态生长和建成过程，从而对其致病性产生一定的影响。
关键词：胶胞炭疽菌;几丁质脱乙酰酶;孢子萌发;附着孢;突变体;致病性
中图分类号：S436.67
文献标识码：A
文章编号： 1000-4440f 2018）05-1013-09
芒果（Mangifera indica L）是世界著名的热帶水果之一，深受消费者和果农的喜爱，也是中国主要栽培水果之一。胶孢炭疽菌（Colletoirichum gloeospori-oides）是世界性的、广谱的、潜伏性侵染芒果的常发性病原菌之一，主要危害嫩叶、新梢、花及果实，尤其是引起贮运期的果实腐烂，降低果实的品质和外观质量，造成采后重大损失。由于胶孢炭疽菌的寄主范围广泛，侵染策略多样，目前还没有安全有效的防治策略。挖掘该菌在侵染致病过程中的功能基因，并了解其在胶孢炭疽菌与寄主互作过程中的机制，对于有效防治胶孢炭疽病菌引起的采后病害具有重要的理论和实践意义。这也是植物病原真菌研究的热点领域之一。
几丁质脱乙酰酶（CDA）是一种糖蛋白，可催化植物病原真菌细胞壁几丁质分子脱去乙酰基生成壳聚糖。目前，已从多种真菌中分离纯化获得CDA蛋白，也已从鲁氏毛霉（Mucor rouxii）、菜豆炭疽菌（Colletotrichum lin，demuthianum）、布克须霉（Phycomyces blakesleeanus）、裂褶菌（Schizo-phyllum communeand）、麦类白粉病菌（Blumeriagraminis）及酿酒酵母（Saccharomyces cerevLsLae）等微生物中克隆得到CDA基因。已有研究结果证明CDA基因在病原真菌生长发育及侵染致病过程中有多种功能。例如鲁氏毛霉（M.rouxu）和蓝色犁头霉（A.coemlea）的CDA参与细胞壁壳聚糖的合成，酿酒酵母（S.cerevisiae）的CDA可维持子囊孢子细胞壁的硬度，cdaJ基因缺失的裂殖酵母（S.pombe）产孢及孢子形态异常。菜豆炭疽菌（C.lin，demuthianum）、黄瓜炭疽菌（C.lan，gen，arium）和构巢曲霉（A.nidulan，s）的CDA参与其对植物的侵染致病过程。
在植物和病原菌的互作过程中，致病力大小由病原菌自身产生的致病因子和寄主植物的抗性两方面的因素决定。有研究结果显示，高乙酰化程度的几丁寡糖和寡肽同乙酰化程度低的复合物相比，可有效增加植物对病原真菌的抗性。Siegrist等和李春娟等研究认为，病原菌产生CDA降解自身细胞壁几丁质产生多糖聚合物，多糖聚合物可逃避植物的几丁质酶对病原菌细胞壁的水解，同时脱乙酰化产物壳聚糖可能起抗性反应激发子的功能，抑制植物体致病因子激发的免疫反应，从而促进定殖。这一相互作用在黄瓜炭疽菌（C.langenari-um）中首次被证实。虽然认为病原真菌的CDA决定了其对宿主的致病性，但至今无更多可靠证据证明几丁质的乙酰化程度对植物抗性和病原菌致病力的重要性。另外，根瘤菌nodB蛋白和多数真菌的CDA都具有一个典型的多糖脱乙酰酶结构域，因此也推测真菌的CDA基因在功能上与NodB类似，参与几丁质酶激发的防御反应。目前关于芒果胶孢炭疽菌CDA基因的生物学功能知之甚少。Alkan等发现C.gloeosporioides存在3个CDA相似基因，CDA1基因的缺失对菌株的致病性没有显著影响。本研究对其中的CgCDA3基因进行生物信息学分析，并通过基因敲除策略研究基因缺失对C.gloeosponoLdes生长及侵染致病力的影响，为明确CDA基因在炭疽病菌致病过程中的功能提供更多的实验证据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和果实 野生型C.gloeosporioides菌株为从芒果果实上分离的具有强致病性的单孢培养物，CgCDA3基因缺失突变株的构建由本实验室完成。用于胶孢炭疽病菌接种及致病力分析的芒果果实材料为广东、海南等地的栽培种象牙芒。
1.1.2 培养基及缓冲液 ①M，S培养基：MgS04·7H20 2.5 g/L、KH2P04 2.7 g/L、胰化蛋白胨1.0 g/L、酵母提取物1.0 g/L、蔗糖10.0g/L、氯霉素250.0mg/L、琼脂粉20.0 g/L。②诱导培养基：K，HPO4 4.0 g/L、MgS04·7H20 2.0g/L、CaCl2·2H20 0.3 g/L、FeCl3 10.0 mg/L、葡萄糖50.0 mmol/L，pH4.0或者pH7.0。③再生（REG）培养基：甘露醇145.7g/L、酵母提取物4.0g/L、可溶性淀粉1.0g/L（固体培养基添加琼脂粉16.0 g/L）。④豌豆汁培养基：取1L的大烧杯，加入从超市购买的冷冻豌豆至400 ml处左右，加蒸馏水至500 ml，高压灭菌使豆子软化，待冷却后将豌豆捣碎，用Microcloth过滤，过滤后约得到250 ml豌豆汁，分装至50 ml离心管，13000 r/min离心20 min后取上清液，再次灭菌，备用。⑤电击缓冲液（pH7.5）：甘露醇9. 109 g/L、羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）0.238 g/L。
1. 1.3抗生素及主要试剂潮霉素B（Hyg B）购自Roche Diagnostics公司，基因组DNA提取试剂盒、Prime ScriptTM RT reagent Kit（ Perfect Real Time）反转录试剂盒、限制性内切酶（NotI）及PCR相关试剂购自TaKaRa公司.RNA提取试剂盒购自北京天恩泽公司.DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自TIANGEN公司。引物的合成与测序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。含有潮霉素（HYG）抗性基因的中间入门载体（Entry clone）由以色列农业研究组织凡卡尼研究中心DOV PROSKY实验室提供。培养基及缓冲液中的常规试剂均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 C.gloeosporioides的培养及继代方法 用M3S培养基进行各菌株的常规继代培养和保存。菌丝的离体初培养：将lxl06 CFU/ml的各菌株孢子接种于40 ml液体M，S培养基中，在26—28 aC条件下150r/min振荡培养3d。进行诱导培养时，将初培养3d的菌丝体清洗过滤后转移至40 ml诱导培养基中，然后在同样条件下进行振荡培养。以上操作均在超净台中进行。收集各菌丝样品置液氮中速冻保存备用。
1.2.2 C.gloeosporioides在离体致病过程中CgCDA3的表达检测 将离体培养3d的胶孢炭疽菌的菌丝，诱导培养2d的孢子及玻璃平板孵育8h和12 h的萌发态孢子和附着胞4个时期的材料，液氮速冻，按照柱式真菌RNAout试剂盒使用说明提取RNA。采用Bio-RadiCycler CFX96Touch Deepwell仪和SYBR Premix Ex Taq试剂盒，按照说明书进行荧光定量PCR试验，比较分析C.gtoeosporioides在离体培养的4个时期CgCDA3基因的表达量，以18SrRNA为内参对照。
1.2.3 C.gloeosporioides的果实接种及致病力检测 挑选果形、果实大小和成熟度一致的芒果果实，自来水清洗并进行果实表面浸泡消毒处理，晾干备用。在果实表面创伤深2—3 mm、直径10 mm的伤口，将菌株孢子液稀释至lxl06 CFU/ml，取10μl滴加在创口上。然后置于室温（22±3）℃、相对湿度（ RH）90%的环境下，定期观察发病情况，测量芒果果实的病斑直径。每个处理的果实数为8个，试验重复3次。在分析CgCDA3基因在C.gloeosporioides活体侵染过程中的表达量时，以接种伤口为中心，取直径40 mm大小的芒果果皮组织，液氮速冻后保存。取样时间分别为：接种病原菌后22 h、48 h、3d、Sd、6d。CTAB法提取RNA，按照反转录试剂盒和SYBRPremix Ex Taq试剂盒说明书进行荧光定量PCR试验，以芒果A ctin，为内参对照。
1.2.4 孢子萌发及附着胞形成的检测和统计方法
菌株在M3S液体培养基中150 r/min、28℃培养3d，抽真空过滤后转移到诱导培养基中再培养2d，4层纱布过滤收集孢子，离心后用灭菌水洗涤定容，用血球计数板在显微镜下对孢子计数。将孢子浓度稀释至lxl05 CFU/ml，滴加10μl孢子液于干净的载玻片上，28℃黑暗高湿条件下诱导其萌发，培养8h和12 h后显微镜下分别观察统计孢子萌发率和附着胞形成率，试验重复3次。
1.2.5 C.gloeosporioides的CgCDA3基因敲除策略
CgCDA3基因的敲除策略见图l。以胶孢炭疽菌基因组DNA为模板，首先利用引物对l和2、3和4（表1）分别扩增CgCDA3基因的5’端和3"端侧翼序列。将获得的5’端和3’端侧翼序列分别进行凝胶回收纯化，分别依次通过BP反应连接到载体pDONRrMP4-Plr和pDONRrMP2r-P3，形成5’端和3’端的Entry clone。通过抗生素筛选、PCR鉴定及序列测定后挑选阳性的5"端和3"端的Entry clone，提取5’端和3’端阳性及含HYG抗性基因的Entryclone质粒DNA，然后将其与pDESTTM R4-R3载体通过IR反应生成用于转化的重组质粒。采用抗生素、PCR鉴定及序列测定筛选正确的重组质粒。最后获得的重组质粒经扩大培养、质粒抽提和纯化后用NotI酶切回收线性重组质粒，用于野生型C.gloeosporioides的电击转化。
1.2.6 C.gloeosporioides感受态的制备及电击转化参考Robinson等的方法制备电击感受态C.gloeosporioides。首先收集在M3S固体平板上生长14 d的野生型孢子，然后加入到碗豆汁培养基中.28℃下200 r/min预培养2.5～3.0 h。预培养后的孢子用预冷的电击缓冲液洗涤3次，再用电击缓冲液浓缩至100μl。电击时将电击缓冲液中的100μl孢子转入电击杯中，立即加入lμg经NotI酶切后的线性重组质粒，然后在电击仪（Gene Pulser Xcell）上立即进行电击转化。电击条件为电压1.4 kV，电容25μF，电阻800 Q，时间常数（Time constant）16—18 ms。电击后立即加入1/20体积的预冷碗豆汁培养基，混匀后涂布至含100μg/ml潮霉素B的REG固体筛选平板上，室温培养3～4 d后进行抗性突变体的筛选、纯化和鉴定。
1.2.7 抗性突变体的筛选鉴定 将在筛选平板上生长出的单菌落（候选阳性基因缺失突变株）分别转至含100μg/ml潮霉素B的M3S固体培养基上，待菌圈扩展至足够大时，分别提取各候选株的菌丝基因组DNA。以各候选株的基因组DNA为模板，采用表l中的引物对l和2、5和7分别扩增5’端侧翼序列及其两端各约100 bp的片段，采用引物对3和4、6和8分别扩增3’端侧翼序列及其两端各约100 bp的片段。能同时扩增出与5’和3’端目的片段大小一致的条带，且经序列测定后与目的片段序列一致的菌株即為CgCDA3基因缺失突变株。一次电击转化可获得多个正确的相应基因缺失突变株，本研究随机选取其中2个（△CgCDA3-2和△CgCDA3-3）进行后续相关试验。
1.2.8 数据统计与分析数据用SPSS 13.O和Ex-cel进行处理和分析。
2 结果与分析
2.1 CgCDA3基因的序列分析及同源比对
根据转录组测序得到的CgCDA3基因片段序列，利用同源检索、聚类、序列延伸等方法从C.gloeosporioides基因组中获得CgCDA3基因全长（结果未显示）。进一步对序列进行生物信息学分析，结果显示，CgCDA3基因含有完整的开放阅读框（ORF），ORF全长1470 bp，预测编码含489个氨基酸的蛋白质，位于基因组Contig 00117。预测蛋白质的结构域分析结果显示，该蛋白质N端含有CE4_SF/CICDA结构域，存在于第289～ 440位氨基酸处（图2），占整个蛋白质序列的30%以上。这是菜豆炭疽菌（Colletotrichum lindemuthLanum）幾丁质脱乙酰酶具有的典型结构，具有催化活性，与苜蓿根瘤菌（S.meliloti）的NodB结构域同源，属于Carbohydrateesterase 4（CE4）超级家族成员。
将该基因编码的氨基酸序列提交NCBI进行BLASTP同源比对，结果表明该CgCDA3蛋白质与已发表的西瓜炭疽菌C.orbiculare（ENH86782）、禾生炭疽菌C.gramin，icda（XP-008096791.1）和睡莲炭疽菌C.n，ymphaeae（KXH27886.1）的乙酰几丁质蛋白质同源性较高，同源性分别为63%、60%和80%（图3）。
2.2 Cg CDA3基因在C.gloeosporioides离体生长及活体侵染过程中的表达
对C.gloeosporioides孢子（Spore）、萌发期孢子（G-spore）、附着胞（Appressorium）、菌丝（Smyceli-um）各时期离体条件下CgCDA3基因的表达量进行qRT-PCR定量分析，结果（图4）显示，CgCDA3基因在胶孢炭疽菌离体生长的不同时期都有不同水平的表达，在萌发期的孢子及附着胞中的相对表达量分别为4.67和4.85，表达量最高，而在孢子和菌丝中的相对表达量分别为1.00和0.78，显著降低。在C.gloeosporioides侵染芒果的致病过程中，仅在侵染致病期已感病的果皮和病斑的混合组织中检测到CgCDA3基因的高水平表达，而在接种后至感病前的各个阶段CgCDA3基因的表达水平几乎为0（图4）。说明CgCDA3基因表达与后期的致病力密切相关。
2.3 胶孢炭疽菌Cg CDA3基因敲除缺失突变体
要证明CgCDA3基因在C.gloeosporioides离体生长及侵染果实致病过程中的作用，获得其基因缺失突变体是最直接的证据。因此，我们通过基因敲除策略，用潮霉素B抗性基因替换CgCDA3基因ORF获得2个基因缺失突变菌株，分别为△cda3-2和△cda3-3。以各菌株的基因组DNA为模板，用引物对6、8和引物对5、7分别从潮霉素B抗性基因序列两端扩增3’端和5’端侧翼序列，结果（图5）显示，在野生型菌株及纯水对照中没有扩增产物，而在CgCDA3基因缺失突变菌株△cda3-2和△cda3-3中，3’端和5’端分别扩增出大于500 bp和1 000 bp的片段：同时用引物对3、4和引物对l、2也分别从△cda3-2和△cda3-3中扩增出了3’端和5’端的相应插入基因片段，而野生型菌株中没有相应扩增产物。对扩增的3 ’端和5’端片段产物的测序结果显示，其与设计敲除CgCDA3基因时采用的同源重组片段序列完全一致。另外，与野生型相比较，缺失突变菌株△cda3-2和△cda3-3中CgCDA3基因的表达量几乎为0（图5）。PCR扩增测序及基因表达检测结果证明△cda3-2和△cda3-3两个菌株中的CgCDA3基因被潮霉素B抗性基因取代，为CgCDA3基因缺失突变菌株。
2.4 CgCDA3基因缺失突变体在培养基上的菌圈生长变化
图6显示CgCDA3基因缺失突变菌株△cda3-2和△cda3-3在添加150μg/ml潮霉素B的M3S培养基上，菌圈可正常生长扩展，一定时间后产生分生孢子，而野生型C.gloeosporioides菌圈扩展至直径3 cm左右时即停止生长，产孢过程也被抑制，表明突变株具有潮霉素B的抗性。在不含潮霉素的M3S培养基上，CgCDA3基因缺失突变菌株△cda3-2和△cda3-3的生长速率与野生型无差异，菌圈可正常生长扩展。说明潮霉素B抗性基因取代CgCDA3基因造成的缺失对C.gloeosporioides的离体生长、菌圈扩展和产孢过程没有明显影响。
2.5 CgCDA3基因缺失突变体的孢子萌发与附着胞形成变化
离体条件下培养C.gloeosporioides获得的孢子在28 cC孵育8h和12 h分别观察孢子萌发和附着胞形成情况。结果（图7）显示，野生型的孢子萌发率为85.9%，CgCDA3基因缺失突变菌株△cda3-2和△cda3-3的孢子萌发率分别为59.6%和63.4%，与野生型相比较分别下降了26.3个百分点和22.5个百分点：野生型C.gloeosporioides萌发的孢子分化形成附着胞的比率为73.38%，而CgCDA3基因缺失突变菌株△cda3-2和△cda3-3的附着胞形成率明显下降，分别下降至50.51%和51.53%。与野生型相比，CgCDA3基因缺失突变菌株△cda3-2和△cda3-3的孢子萌发率和附着胞形成率均明显降低，说明CgCDA3基因参与C.gloeosporioides孢子萌发和附着胞形成。
2.6 CgCDA3基因缺失突变体对芒果果实的致病力变化
对芒果进行创伤接种胶孢炭疽菌，在果实的左侧创伤接种野生型菌株作对照，右侧接种缺失突变菌株△cda3-2和△cda3-3，在接种后的不同时间观察统计病斑直径变化。结果（图8）显示，接种后第6d野生型菌株侵染诱导的病斑直径平均扩大至6.93cm，而△cda3-2侵染诱导的病斑直径平均值为2.42cm，与野生型比较降低达65.1%，差异显著，缺失突变菌株△cda3-3的病斑直径也呈现同样的变化趋势。在另一个重复的基因缺失单细胞株系中，CgCDA3基因的缺失导致C.gloeos-porioides致病性降低46%。CgCDA3基因缺失突变菌株△cda3-2和△cda3-3的致病力降低，说明CgCDA3基因的功能与C.gloeosporioides的侵染致病力密切相关。
3 讨论
C.gloeosporioides基因组中存在3个CDA相似基因，它们在染病芒果果皮下坏死组织中有不同程度的表达，敲除CDA1基因对菌株的致病性没有显著影响，说明不同CDA基因的功能存在差异，CDA2和CDA3基因可能对其致病性起关键功能作用。本研究对其中的CgCDA3基因進行生物信息学分析，结果显示编码的氨基酸序列N端含有催化真菌细胞壁中的几丁质脱乙酰化为壳聚糖的CICDA结构域，这也是鲁氏毛霉（M. rouxii）、酿酒酵母（S.cer-evLSLae）和菜豆炭疽菌（C.lin，demuthianum）等病原菌CDA具有的典型结构。在这些病原真菌中，几丁质的脱乙酰化对其生长发育和侵染致病性均有不同的作用。目前关于芒果胶孢炭疽菌CDA基因的生物学功能知之甚少。本研究通过基因敲除策略直接证明CgCDA3的缺失导致C.gloeosporioides孢子萌发和附着胞形成率降低，同时侵染芒果的致病性也显著减弱，说明CgCDA3基因在侵染致病过程中起着重要的作用。这与菜豆炭疽菌（C.lin，demuthia-n，um）、黄瓜炭疽菌（C.lan，gen，arium）和构巢曲霉（A.nidulans）中CDA参与致病过程的研究结果一致，这为了解CDA基因在采后病原真菌中的功能提供了新的证据。
在植物与微生物互作的研究中发现，植物体中几丁质酶是一种重要的水解酶，在植物抵抗病原菌的防御反应中发挥着重要的作用。它通过降解病原真菌细胞壁中的几丁质致使病原体死亡，降解产生的细胞壁碎片和寡糖产物还具有诱导作用，刺激寄主植物诱发一系列抗病反应。同时，病原菌可通过分泌产生CDA水解自身的几丁质脱去乙酰基，从而增加寄主识别几丁质底物的困难，并降低寄主几丁质寡糖的激发子活性，继而拮抗寄主中的几丁质酶。在病原菌侵染部位乙酰化的几丁质由于病原菌CDA的产生快速脱乙酰化，病原真菌的几丁质乙酰化程度影响植物细胞的抗性功能。为了了解C.gloeosporioides侵染致病过程中宿主几丁质酶活性变化，我们预试验中检测了芒果果实几丁质酶基因表达的变化，但结果并无规律可循。说明病原菌CDA水解自身几丁质以抵抗宿主的防御反应及与宿主几丁质酶的水解产生抗性之间存在非常复杂的相互作用关系，可进一步采用生理生化手段直接观察病原菌几丁质的脱乙酰化程度与植物的抗性和病原菌致病力的关系，以明确CgCDA3是否通过脱乙酰化自身几丁质以抵抗寄主的防御反应而参与致病力的形成。本研究CgCDA3基因缺失突变体与野生型相比，生长及产孢正常，但孢子萌发和附着胞形成能力下降，因此至少可以推测CgCDA3基因参与调控胶孢炭疽菌孢子萌发和附着胞形成等生长和形态建成过程，从而促进其致病性产生。