康脑灵胶囊对血管性痴呆模型大鼠体内自由基代谢影响的研究

血管性痴呆(VD)是我国也是世界上老年性痴呆的主要类型之一,其病理机制和治疗方法是目前国际研究探讨的热点。血管性痴呆系大脑皮层获得性高级神经系统机能的全面损害,是以健忘、呆笨为主要临床表现的一种脑机能衰退性疾病。在国际流行病学调查中,老年发病率为40%~48%,我国老年人口的增长速度甚快,血管性痴呆年发病率亦在逐步上升[1]。对于本病的发病因素及治疗,国内外许多学者已做了大量的基础与临床研究,但至今效果均不理想。血管性痴呆属于中医“痴呆”、“呆病”、“健忘”、“癫狂”等范畴。在中医学理论体系指导下的中草药临床应用,是我国老年医学的独特优势,因此,采用国际公认的诊断标准,开展中医药治疗VD的研究,是目前国内研究VD的趋势。利用现代科学理念和先进技术,遵循中医以人为本、整体观念、辨证论治、形神统一理论,追踪脑科学领域的研究热点,是我国痴呆防治研究的特点和优势。中医临床在治疗老年血管性痴呆方面多采用活血化瘀、补肾等方法,其中康脑灵颗粒剂治疗取得较好地效果。

本实验采用FeCl3溶液贴敷脑膜软组织,诱发实验大鼠脑血管损伤模型可导致脑部缺血、缺氧、自由基代谢紊乱,从自由基代谢来研究血管性痴呆,将有助于发现、预防和治疗血管性痴呆的新办法。现将实验研究报告如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠50只,体质量200 g~250 g,山东大学医学院实验动物中心提供。

1.2 实验仪器

不锈钢恒温水浴槽(温州奥利生物医学仪器厂)、超速组织匀浆机(中国上海医疗器械厂)、超速震荡器(上海魏立信科技有限公司)、BC-163k超低温冷冻箱(中国海尔)、塑料试管、一次性塑料吸管、试管架、移液器、大鼠代谢笼(苏杭动物实验中心产品)BECKMAN-700全自动生化分析仪(BECKMAN公司)、723型可见光分光光度计(上海第三分析仪器厂)等。

1.3 试验药物

1.3.1 受试药物 康脑灵颗粒剂由山东中医药大学实验药厂提供,6 g/袋(含生药量为22 g),成人用量18 g/d,(含生药量为 66 g),由山东中医药大学附属医院制剂室负责加工,批号980421。动物实验过程中用药全部为康脑灵颗粒剂。实验前配成①康脑灵颗粒剂中剂量组(简称康中组)0.45 g/ml浓度的混悬液, 灌胃3 ml/次(相当于人日用量的17.5倍,含药量为5.4 g/kg体质量, 折合成药量为19.8 g/kg);②康脑灵颗粒剂小剂量组(简称康小组)0.30 g /ml浓度混悬液,灌胃3 ml/次(相当人临床日用量10倍,含药量为3.6 g /kg,折合成药量为13.2 g/kg)。

1.3.2 对照药品混悬液制备

对照用药脑复康(Piracetar)由天津市华新制药厂,批号20030302,成人日用量2.4 g /d,实验前按28 mg/100 g配成混悬液,供大鼠实验,灌胃用药量为1 ml/100 g。

1.4 实验试剂

50%FeCl3盐酸溶液;2%戊巴比妥;SOD试剂盒、MDA试剂盒。

1.5 动物模型实验方法

造模方法:FeCl3溶液敷贴阻断大鼠大脑中动脉造成局部缺血、组织损伤模型建立。[2]

1.5.1 原理 将化学物质Fecl3滴加于血管表面,使局部动脉壁受损,该部位PGI2合成减少,损伤部位有胶原暴露,血流通过时,血小板易粘附、释放、聚集形成血小板血栓。纤维蛋白原附着其上,网落红细胞,形成混合型血栓。在临床上大脑中动脉为血栓的常发部位,本模型与临床脑血栓的形成有相似之处。

1.5.2 模型操作方法 用健康雄性Wistar大鼠,50只,每组10只,体质量200~250 g,首先腹腔注射2%戊巴比妥按0.2 ml/100 g麻醉,右卧位固定,在眼外肌和外耳道连线中点做一弧形切口,长约1.5 cm,夹断颞肌并切除,暴露颞骨,用牙科钻在颞骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1 mm处作直径为2.5 cm的骨窗,清理残渣,暴露一段大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间),显微镜下置一小片塑料薄膜保护血管周围组织。置一小片中间开孔的塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有10 μl 50%FeCl3盐酸溶液的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上,30 min后取下滤纸,用生理盐水冲洗局部组织,逐层缝合后,回笼饲养。假手术组仅在右侧脑部钻孔,用等量生理盐水纸片贴敷。术后8~14 d进行学习记忆训练,保证每组有8只大鼠进行测试。

1.5.3 造模成功的指标 大鼠清醒即刻进行神经功能评分,按照Zea longa[8];5分制评分标准进行(0分:无神经损伤症状;1分:不能伸展对侧前爪;2分:向外侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。)凡出现神经损伤症状的均视为造模成功。正常组不进行任何处理,与其他组动物同期喂养。

1.5.4 动物模型的建立、分组与手术情况

Wistar大鼠50只,随机分为5组,每组10只,①手术组(又称手术组)予等量生理盐水灌胃,1次/d;②康中组(简称康中组)予康脑灵(复方吡拉西坦脑蛋白水解物)3 ml/次(含药量5.4 g /kg);③康小组(简称康小组)3 ml/次(含药量3.6 g /kg);④阳性对照药组(又称脑复康组)予脑复康(吡拉西坦)3 ml/次(280 mg/ kg);⑤正常组(又称为假手术组)予生理盐水灌胃,3 ml/次,1次/d;均饲以普通饮食。在动物室内正常饲养7 d以稳定动物情绪。第8天进行手术。于手术后第2天开始给药。每天灌胃给药1次,连续14 d。

1.6 统计学方法

数据统计以SAS软件单因素方差分析进行处理,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 超氧化物歧化酶(SOD)活力检测 取血清或组织匀浆 ,按山东中医药大学标准化测试要求进行[3]。

2.2 质过氧化物丙二醛(MDA)检测 取血清和组织匀浆,按山东中医药大学标准化测试要求进行[4]。

2.3 Fecl3损伤大鼠血浆MDA含量、SOD活力的影响 结果见表1,图1、2。

实验结果表明,表1中对FeCl3所致脑损伤大鼠血浆中MDA含量及SOD活力,以手术组MDA增多,SOD活力下降,康中组与手术组比较差异有统计学意义(P<0.05);而康小组与脑复康组与手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

血管性痴呆属于中医“呆病” 或智能减退的范畴。“痴呆”作为一种疾患,早在2000年前的祖国医学文献中就已有论述。祖国医学不仅从整体上认识到老年人易患痴呆的现象,而且进一步观察到血瘀证、中风和痴呆之间的内在联系。

现代医学认为凡与血管因素有关的痴呆,统称为脑血管性痴呆。痴呆实际上是泛指大脑功能,特别是与智能有关的功能全面衰退,而且要衰退到一定程度的综合征。通常包括记忆力、认知力、情绪与行为等一系列的症状与体征,并且持续数月或半年以上,与各种缺血性脑血管、组织损伤发病因素有关。

3.1 康脑灵颗粒剂组方分析 针对瘀阻脑络是基本病机,即根据“疏其血气,令其调达”及“损有余而益不足”的原则,肾虚是病之根本,以活血化瘀,补肾益智为治法,旨在以活血化瘀,疏通脑络为主,补肾益智为辅,通补兼施,以通为主,达到气血调畅,瘀去新生,气旺血活,使机体恢复“阴平阳秘,精神乃治”的正常状态。

本方由川芎、当归、银杏叶、淫羊藿等组成,功能活血化瘀,补肾益智。

川芎味辛,性温。入肝、胆、心包经。功专活血行气,故能活血化瘀,通脑络。①川芎嗪为钙拮抗药,防止神经细胞内钙超载。增加血管的致密性,对缺血性脑损害有一定的短期改善效应;②改善脑组织供氧和利用能力,促进组织的能量代谢,稳定亚细胞器的膜结构,减轻脑缺血对脑细胞损害 [5];③具有清除自由基的能力;④川芎水煎剂可以改善小鼠记忆获得障碍和记忆再现障碍,从而提高小鼠的学习记忆能力;⑤可显著减少静脉壁白细胞黏附,延缓并减轻微循环内红细胞的聚集性,加快红细胞电泳速度,降低血小板黏附率,从而防止血液黏度升高[6]。

当归,性味甘苦辛温,入心、肝、脾经。本品辛温之性可助川芎活血化瘀,甘补之性可使气血充盛,血盛则流畅无瘀,润性可防川芎之辛燥;①阿魏酸能明显改善脑损伤大鼠记忆能力,对乙酰胆碱的作用最明显[7];②能降低血浆纤维蛋白原浓度,增加细胞表面电荷,以促进细胞解聚,降低血液黏度[6];③对人血超氧化物歧化酶(SOD)有十分显著的激活作用[8],其所含的能使大鼠脑匀浆的过氧化脂质(LPO)形成减少 [9];④可降低脑内过氧化脂质水平和B型单胺氧化酶的活性;⑤能降低血浆纤维蛋白原浓度,增加细胞表面电荷,以促进细胞解聚,降低血液黏度[11];⑥可降低脑内过氧化脂质水平和B型单胺氧化酶的活性 [10]。

银杏叶,性味甘、苦、涩平。入心、脾、肺经。具有活血止痛,益心敛肺,化湿止痛之功。①银杏叶总黄酮治疗老年性脑功能障碍、脑伤后遗症等,疗效显著,它使患者的反应加快,记忆改善,症状好转。能促进动物学习记忆过程,提高记忆再现力。醇提取物及水提取物均能明显改善和促进记忆保持的作用。其机制可能与影响中枢胆碱能神经有关;②具抗氧化作用;③降低血脂、抗血栓和防止动脉硬化症作用;④扩张心脑血管作用。

淫羊藿,性味辛、甘、温。入肝肾经。功专补肾助阳。方中川芎善行气血,诸药相伍,通补兼施,共奏活血化瘀,补肾益智之功。①淫羊藿多糖和粗黄酮对正常大鼠经ADP诱导的血小板聚集作用,淫羊藿总黄酮通过降低细胞的聚集性而降低全血黏度[18];②淫羊藿有抗衰老作用明显增加;③具有显著的抗氧化作用。

3.2 缺血性脑组织损伤后对模型大鼠体内自由基代谢异常与VD的关系 血管性脑损伤是多种因素参与的复杂病理过程,而氧自由基引起的组织脂质过氧化损伤是重要因素之一,脑组织富含不饱和脂肪酸,因此,最易受自由基攻击。SOD是机体清除自由基酶系统中的较重要的酶类,其清除自由基的能力与酶的活性成正比,能不断地清除多余的自由基,保证人体自由基代谢平衡。在脑急性缺血时,由于缺血造成氧供应下降和ATP减少,使脑细胞正常代谢途径受到破坏,经各种途径使氧自由基急速蓄积并造成脑损伤。大鼠脑缺血再灌注的急性期可产生大量的自由基,使MDA含量升高,并消耗SOD而使其活性下降,而且自由基的大量产生是迟发性神经元损害的主要原因,可以认为SOD活性下降,MDA含量升高,加剧缺血脑组织损伤,加重脑损伤大鼠脑组织病理变化。自由基损伤和脂质过氧化反应在血管性脑损伤发病过程中作用已引起广泛的重视。脑组织的缺血以及再灌注过程中产生大量的自由基,自由基与生物大分子、尤其是生物膜上的不饱和脂肪酸反应,形成脂质过氧化物(LPO)能破坏边缘系统Papez与Livergston环路的完整性和统一性,导致脑损伤的发生。脑缺血发生后,SOD等自由基清除酶功能受到损害,自由基清除能力下降参与了脑缺血再灌注损伤的发病机制,是导致该模型动物神经细胞发生迟发性神经元死亡的一个重要原因。

实验结果表明,手术组自由基含量显著增加,因此脑组织中丙二醛及含量明显增加,SOD活性下降。用药组脑组织中SOD活力提高,丙二醛含量明显减少,与手术组比较均差异显著,表明康脑灵颗粒剂含有抗氧化剂的保护作用,对机体内的抗氧化能力增强,能抵抗自由基损伤,可延缓细胞的衰老死亡和脑组织进行性萎缩性退化,改善脑损伤症状,提高脑损伤患者生活质量。

参考文献

[1] 田金洲.血管性痴呆.人民卫生出版社,2003.

[2] 王北婴,李仪奎.康脑灵颗粒剂新药研制开发技术与方法.上海科学技术出版社,2001:627.

[3] 姚晓渝,周恩平,余美娟,等.附地黄口服液降血糖及抗氧化作用研究.医学生物物理学,1996:31-33.

[4] 魏明竟.血浆过氧化脂质的测定及其临床意义.国外医学•临床生物化学与检验分册,1984,5(1):6-8.

[5] 杨其炳,陶静仪.中国当归药理研究进展.中草药,1993:43.

[6] 王谦.汉方处方中当归及其对乙酰胆碱的作用:当归对阿耳茨海默型痴呆的效果.国外医学•中医康脑灵颗粒剂分册,1991,12(5):10-11.

[7] 刘汇波.淫羊藿黄酮对抗小鼠D-半乳糖衰老模型的研究.中药药理与临床,1990,(2):18.

[8] 吴荪.自由基与临床医学.微循环杂志,1998,8(3):34.

[9] 夏春林,金涛,魏福堂.细胞凋亡与AD病的关系.苏州医学院学报,2000,20(12).

[10] 叶鑫生,等.细胞调控的探索.军事医学科学出版社,1994:253.