摘 要 利用细菌16S-23S rDNA内源转录间隔区通用引物L1/L2扩增烟草青枯病菌基因组DNA，并对其扩增产物进行克隆测序，经与近缘种序列多重比对分析后，设计1对特异性引物RsF/RsR，用于包括烟草青枯病菌在内的15种不同细菌、5种真菌、3种卵菌基因组DNA的PCR扩增。结果表明：在优化的反应体系与程序条件下，该对引物只能从烟草青枯病菌中扩增出241 bp的特异片段，并通过序列测定验证了其准确性；将引物RsF/RsR与细菌通用引物L1/L2进行巢式PCR扩增后，其检测灵敏度在DNA水平上可达0.4 fg/μL，较常规PCR 提高1 000倍，表明该对引物能有效地用于烟草组织及土壤中青枯病菌的检测。此结果对烟草青枯病的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。
关键词 烟草；青枯病菌；巢式PCR；分子检测
中图分类号 S435.72 文献标识码 A
Abstract Based on differences in the sequences of 16S-23S ribosomal DNA of Ralstonia solanacearum in tobacco and the other closely related species， a pair of primers RsF/RsR were designed and a PCR assay was developed in the study. Among 47 isolates representing 15 bacteria species including R. solanacearum in tobacco and 8 other fungi and oomycetes species， only a single PCR band of 241 bp amplified with DNA extracted from all isolates of R. solanacearum in tobacco， while other tested isolates had no corresponding band. The detection sensitivity increased 1 000-fold to 0.4 fg/μL genomic DNA by developed a nested PCR procedure with bacterial universal primer pair L1/L2 as the first round primers and RsF/RsR as the second round primers. The results showed that nested-PCR assays provided a rapid and sensitive method for the detection of R. solanacearum from naturally infected tobacco tissues and diseased soil samples. It has great significance for early diagnosis and rapid detection of tobacco bacterial wilt， and the research of disease epidemiology.
Key words Tobacco；Ralstonia solanacearum；Nested-PCR；Molecular detection
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.022
由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum E. F. Smith）引起的烟草青枯病是威胁世界烟草生产的一种毁灭性病害，广泛分布于热带、亚热带地区。该病在中国南方烟区普遍发生，近年来有逐渐加重的趋势[1-3]。目前对烟草青枯病菌的检测大多仍采用传统的分离培养和血清学鉴定方法，传统的检测方法耗时长且灵敏度较低，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，免疫血清学鉴定方法虽已建立，但血清的制备过程耗时耗力，且可能存在交叉反应，容易造成假阳性[4]，这些方法的应用均受到一定的限制。因此，建立一种快速、灵敏、准确的烟草青枯病菌检测技术对该病及时、有效地防治具有十分重要的意义。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术因其具有快速、特异、灵敏的特点已被广泛应用于病原微生物的检测。国内外应用PCR技术对青枯病菌的检测研究已有报道，主要是针对青枯菌核糖体基因[1、5]、功能基因[1-3]及未知片段[6-7]设计引物进行检测，其中核糖体转录间隔区ITS序列是由交替的保守区和可变区组成，在微生物基因组中以多拷贝出现，具有种的特异性，因此该序列成为在种的水平鉴定细菌极好的目标。目前，具有更高灵敏度的巢式PCR技术已在一些植物病原菌检测中得以应用[8-10]，但有关烟草青枯病菌的检测鲜有报道[11-12]，且灵敏度不太理想。为此，本研究根据16S-23S rDNA的ITS区段序列在细菌种间高度变异和种内稳定性特点，设计烟草青枯病菌特异性引物，并结合细菌通用引物建立巢式PCR检测体系，对烟草青枯病菌及带菌植株或土壤进行专化性检测，以期为该病的早期诊断和及时采取有效的防控措施提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验供试菌株、寄主及来源详见表1，所有菌株均保存于本实验室。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 卵菌和真菌基因组DNA的提取参照改良的CTAB法[13]；细菌DNA的提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；植物组织DNA的提取参照NaOH快速裂解法[14]；土壤DNA的提取采用土壤基因组DNA快速提取试剂盒（购自北京百泰克生物科技有限公司）。
1.2.2 16S-23S rDNA ITS序列扩增、克隆和测序 细菌16S-23S rDNA ITS序列扩增的通用引物为L1：5′-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3′和L2：5′-GTGCCAAGGCATCCACC-3′。采用25 μL反应体系：2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+ free），2.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 U Taq DNA聚合酶，10 μmol/L 的上、下引物各0.5 μL，25 ng DNA模板，不足部分由ddH2O补足。反应程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增结束后取10.0 μL PCR产物于含0.5 μg/mL EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照。PCR扩增产物在T-vector上克隆后，由生工生物工程（上海）有限公司测序。
采用DNAMAN软件对测序结果及GenBank数据库中已登录的青枯菌近缘种基因组序列进行同源性比较，选取差异位点进行引物设计。
1.2.3 特异性检测 采用合成特异引物对供试菌株基因组DNA进行PCR扩增，并检测其特异性，以灭菌的ddH2O为阴性对照。PCR反应体系同1.2.2。反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增结束后取5 μL PCR产物于含0.5 μg/mL EB的1.5%琼脂糖凝胶中电泳30 min（100 V），在凝胶成像系统上检测并拍照。PCR扩增产物进行克隆测序，通过序列比对验证其准确性。
1.2.4 灵敏度检测 采用10倍浓度系列稀释法将提取的烟草青枯病菌基因组DNA依次稀释成1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL共7个不同浓度梯度，采用巢式PCR对引物的灵敏度进行测定。分别取1 μL不同浓度的烟草青枯病菌基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA通用引物L1/L2进行第1轮PCR扩增，反应体系和反应程序同1.2.2。反应结束后将PCR产物稀释100倍，分别取1 μL做为DNA模板，用引物RsF/RsR进行第2轮PCR扩增，反应体系和反应程序同1.2.3。取5 μL第2轮PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 田间发病烟草植株或土壤的检测 以从福建龙岩、三明、南平采集的32份青枯病典型症状或可疑症状的烟草植株及8份连作2～3 a发病烟田土样基因组DNA为模板，将模板进行10、50、100、500、1 000倍稀释，烟草植株采用常规PCR检测，土壤样品采用巢式PCR检测。以烟草青枯病菌基因组DNA为阳性对照，以健康烟草组织作为阴性对照。
2 结果与分析
2.1 特异引物的设计
用细菌通用引物L1/L2对烟草青枯病菌基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物克隆测序，根据测序结果，设计获得烟草青枯病菌的特异引物，序列如下：RsF：5′-GGCGGCGAGAGCGATCT-3′，RsR：5′-ATTGCGCGCCTCATCAACGCG-3′。其包含引物序列在内的片段大小为241 bp。
2.2 引物特异性检测
利用设计的特异性引物RsF/RsR对供试菌株（表1）的基因组DNA进行PCR扩增，进一步测序验证的结果表明，只有在烟草青枯病菌中扩增到241 bp的目的条带，测序比对后与烟草青枯病菌ITS片段序列完全一致，其它供试菌株和空白对照均未扩增到预期产物（图1），表明该引物具有很高的特异性。
2.3 引物的灵敏性检测
以L1/L2为外引物，RsF/RsR为内引物对不同浓度的烟草青枯病菌基因组DNA进行巢式PCR灵敏性验证。结果第1次以L1/L2为引物扩增时，在25 μL反应体系中，以1 ng至10 pg的基因组DNA为模板时均能得到预期带，表明其检测的灵敏度为0.4 pg/μL；而第2次以RsF/RsR为引物扩增时，在以10 fg基因组DNA为模板时仍然可扩增到241 bp的特异条带。可见，巢式PCR反应可使检测灵敏度提高1 000倍，灵敏度达到0.4 fg/μL（图2）。
2.4 烟草发病植株和土壤的检测
采用常规、巢式PCR分别对采集的烟草植株、土壤样本进行检测，结果显示，28份烟草植株及6份土样为青枯病菌阳性，即能稳定地扩增出一条分子量为241 bp的特异条带；6份样本未获得检测，结果为阴性，部分电泳结果见图3。对供试的烟草植株及土壤样品采用常规分离培养及显微镜形态观察的方法进行验证，取得了一致的结果，说明该套技术能用于发病烟草组织或土壤中青枯病菌的快速检测及病害的早期诊断。
3 讨论与结论
核糖体转录间隔区是20世纪90年代发展起来的全新的分子标记。利用核糖体rDNA序列在物种进化过程中的保守性和异变性设计引物，并建立病原菌和快速检测的方法已得到广泛应用[15]。本研究根据测序得到的烟草青枯病菌序列与GenBank中已登录的青枯菌近缘种rDNA-ITS区序列进行比对，设计出对烟草青枯病菌基因组DNA有高度特异性的1对引物，对15种不同细菌、5种真菌、3种卵菌基因组DNA进行PCR扩增，结果只有对不同来源的烟草青枯病菌能扩增出241 bp的特异性条带，其余菌株DNA模板及空白对照均无扩增产物。利用此特异引物对发病的烟草植株或烟田土壤进行PCR或巢式PCR检测，结果只能从烟草发病组织或带菌土壤中扩增出目的条带，而健康烟株或不带菌土壤没有目的条带产生。表明此特异引物可用于烟草组织或烟田土壤青枯病菌的分子检测及病害的早期诊断，为该病防控措施的制定提供重要保障。
目前已有利用PCR或巢式PCR技术对烟草青枯病菌进行检测的报道[1-3、11、12、16]，但灵敏度较低。郭淼淼等[1]以青枯菌16S rDNA ITS及fliC基因为靶点设计引物对烟草青枯病菌进行检测，其检测灵敏度在DNA水平上均可达到l0 fg/μL；吴金钟等[2]根据青枯菌egl基因设计烟草青枯病菌PCR引物，检测灵敏度为100 fg/μL基因组DNA；杨姣弟等[3]根据青枯菌rpsS等基因序列差异设计特异性引物，对烟草青枯菌悬液最低检出率为105 cfu/mL（据郭淼淼等报道，105 cfu/mL菌悬液相当于10 pg/μL基因组DNA）；贾春燕等[16]建立烟草青枯病菌的PCR检测体系，对青枯菌基因组DNA检测灵敏度为100 fg/μL。Poussier等[11]从hrp基因区域设计引物对青枯菌进行巢式PCR扩增，其检测灵敏度为103 cfu/mL；Khakvar[12]等利用前人设计的引物通过巢式PCR检测烟草组织或土壤中的青枯菌，检测灵敏度为104～106 cfu/mL。据报道，巢式PCR与常规PCR相比，一般可将引物的灵敏度提高100～1 000倍[8-12]。为此，本研究在细菌ITS区通用引物L1/L2的内部设计了1对特异引物RsF/RsR，并建立烟草青枯病菌巢式PCR检测体系，利用该体系对引物的灵敏性进行检测，发现在25 μL反应体系中，以10 fg基因组DNA为模板时仍然可扩增到目的条带，可见其检测灵敏度在DNA水平上可达到0.4 fg/μL，比之前文献中报道的更灵敏。
据报道，罗香文[17]设计的引物AU759/AU760不但可用于鉴定从辣椒上分离到的青枯病菌，也可鉴定从番茄、茄子、桉树、甘薯、烟草、木麻黄等其他作物上分离到的青枯病菌；郭淼淼等[1]设计的引物对RaITS-1/2、Ralflic-F/R对烟草青枯菌、辣椒青枯菌、番茄青枯菌、苦瓜青枯菌、罗汉果青枯菌均是特异的、灵敏的。本研究设计的烟草青枯病菌特异引物，就扩增片段同源性比较结果来看，其他作物青枯病菌用该引物进行PCR，也有可能扩增出同样大小的目的条带，但若试图用于其他寄主青枯病菌的检测，还应进一步测试更多该寄主相关的病原菌。
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