摘要：采用滤纸片法研究了6种不同结构含氟低聚壳聚糖衍生物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、核盘菌、水稻纹枯病原菌、黄花枯萎病原菌、黑曲霉、青霉等7种菌的抑制作用。结果表明，不同含氟低聚壳聚糖衍生物对不同微生物的抑菌活性表现出不同程度的抑菌性。6种含氟低聚壳聚糖衍生物中，除了化合物5对黑曲霉没有抑菌性，其他几种化合物对7种受试菌株都有不同程度的抑菌性；化合物1对大肠杆菌抑制效果较好；化合物2和化合物3对7种微生物均有抑菌性，但抑菌效果较差；化合物4对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄花枯萎病原菌抑制效果较好；化合物5对大肠杆菌抑制效果较好；化合物6对金黄色葡萄球菌、水稻纹枯病原菌、黄花枯萎病原菌抑制效果较好。
关键词：含氟低聚壳聚糖衍生物；滤纸片法；抑菌
中图分类号：TS202.3 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.027
Abstract：The antibacterial effects of six different structures of fluorine oligochitosan derivatives on Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Sclerotinia sclerotiorum，Rhizoctonia cerealis，Rhizoctonia solani，Aspergillus niger and Penicillium were studied by filter paper method. The results showed that the antifungal activity of different fluorine oligochitosan derivatives showed different degrees of antimicrobial activity against different microorganisms. Among the six kinds of fluorine oligochitosan derivatives，except the compound 5 had no bacteriostasis against Aspergillus niger，several other compounds had different antibacterial properties against the seven tested strains. Compound 2 had better inhibitory effect on Escherichia coli：Compounds 2 and 3 had bacteriostatic effect on 7 kinds of microorganisms，but the antibacterial effect was poor. Compound 4 had better inhibitory effect on Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Rhizoctonia solani；Compound 5 had better inhibitory effect on Escherichia coli. Compound 6 had better effect on Staphylococcus aureus，Rhizoctonia cerealis and Rhizoctonia solani.
Key words：fluorine oligochitosan derivatives；filter paper method；antibacterial effect
0 引言
殼聚糖是由甲壳素脱乙酰化制备而成，由氨基葡萄糖和N -乙酰氨基葡萄糖残基通过1，4 - β -糖苷键连接而成的高聚物[1]。壳聚糖是仅次于纤维素的第二大天然可再生聚合物，在医疗、食品、材料等领域都有广泛应用[2]，尤其是在食品防腐保鲜方面使用较为广泛[3]。壳聚糖与一般的抑菌剂相比，具有广谱、抗菌活性高、灭菌率高等特性[4]。由于氟原子具有模拟效应、电子效应、阻碍效应和渗透效应等4种效应，因此其可使化合物的生物活性倍增[5]。过去几十年中含氟农药的数量增加了3倍多，表明氟在新农药发展中发挥着关键作用[6]。将氟引入壳聚糖中，合成含氟低聚壳聚糖衍生物，既可以改善壳聚糖的溶解性，又能提升其抑菌性能，提高应用范围。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、青霉，由学院实验教学中心提供；水稻纹枯病原菌、核盘菌、黄花枯萎病原菌，华中农业大学微生物农药国家工程研究中心提供。
蛋白胨，北京奥博星生物科技有限责任公司提供；牛肉浸膏，北京双旋微生物培养基制品厂提供；琼脂粉，武汉市华顺生物技术有限公司提供；N，N-二甲基甲酰胺，广州市度特化工有限公司提供。
化合物1：壳聚糖缩乙酰邻氟苯甲氨基硫脲；化合物2：壳聚糖缩乙酰间氟苯甲氨基硫脲；化合物3：壳聚糖缩乙酰对氟苯甲氨基硫脲；化合物4：壳聚糖缩乙酰2，3 -二氟苯甲氨基硫脲；化合物5：壳聚糖缩乙酰2，4 -二氟苯甲氨基硫脲；化合物6：壳聚糖缩乙酰3，5 -二氟苯甲氨基硫脲。上述6种含氟低聚壳聚糖衍生物由实验室合成，并经红外光谱和核磁共振光谱进行结构鉴定。
1.2 仪器
MS104S型分析天平；UV-2600型紫外可见分光光度计；SPX-430型生化培养箱，宁波江南仪器厂产品；BXM-50VE型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；JJ-CJ-2FD型超净工作台，苏州市金净净化设备科技有限公司产品。
1.3 方法
1.3.1 培养基的配制
采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培养基（蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 0.5 g，琼脂15～17 g，水1 000 mL，pH值7.4）培养细菌，以马铃薯葡萄糖琼脂培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然）培养真菌。
1.3.2 细菌的活化和菌悬液的制备
准备已灭菌的试管9支置于超净工作台上，待培养基的温度降到50 ℃后，向试管中倒入适量培养基，待其凝固后，取其中7支用接种环在事先准备好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、水稻纹枯病原菌、核盘菌、黄花枯萎病原菌、黑曲霉、青霉生长的菌种中各挑取2～3环菌体，在试管培养基斜面上划线，每种菌接种2个试管，2个试管作空白。细菌置于37 ℃培养箱中，真菌置于28 ℃培养箱中，培养24 h。在600 nm处比色，OD值达到0.1即为菌体浓度为106～107个/ mL的菌悬液[7]。
1.3.3 最小抑菌浓度（MIC）测定
采用滤纸片[8]法进行抑菌试验。选用吸水性较好的滤纸，将做好的滤纸片放入培养皿中高温灭菌，在无菌条件下风干滤纸片，然后将滤纸片放入溶解了6种的含氟低聚壳聚糖衍生物的N，N -二甲基甲酰胺溶液中，每种样品试验5个溶度，1个空白。取出后在无菌条件下晾至不再滴出样品溶液备用。将晾好的滤纸片以相等距离放在涂布菌液的培养基上，每个平皿放6片，中间放置浸过空白滤纸片作对比，每个处理重复3次，最后将放置了滤纸片的培养皿放入培养箱中，细菌在37 ℃下培养24 h，真菌在28 ℃下培养48 h后，进行观察统计抑菌圈的大小。
2 结果与分析
2.1 壳聚糖缩乙酰邻氟苯甲氨基硫脲对微生物的抑菌效果
壳聚糖缩乙酰邻氟苯甲氨基硫脲对7种微生物抑菌效果见表1。
由表1可知，壳聚糖缩乙酰邻氟苯甲氨基硫脲对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、核盘菌、水稻纹枯病原菌、黄花枯萎病原菌、青霉、黑曲霉最小抑制质量浓度分别是7.81，250.00，62.50，250.00，62.50，125.00，250.00 mg/mL。
2.2 壳聚糖缩乙酰间氟苯甲氨基硫脲对微生物的抑菌效果
壳聚糖缩乙酰间氟苯甲氨基硫脲对7种微生物抑菌效果见表2。
由表2可知，壳聚糖缩乙酰间氟苯甲氨基硫脲对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、核盘菌、水稻纹枯病原菌、黄花枯萎病原菌、青霉、黑曲霉最小抑制质量浓度分别是125.00，250.00，125.00，125.00，250.00，250.00，250.00 mg/mL。
2.3 壳聚糖缩乙酰对氟苯甲氨基硫脲对微生物的抑菌效果
壳聚糖缩乙酰对氟苯甲氨基硫脲对7种微生物抑菌效果见表3。
由表3可知，壳聚糖缩乙酰对氟苯甲氨基硫脲对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、核盘菌、水稻纹枯病原菌、黄花枯萎病原菌、青霉、黑曲霉最小抑制质量浓度分别是62.50，250.00，62.50，62.50，125.00，125.00，125.00 mg/mL。
2.4 壳聚糖缩乙酰2，3 -二氟苯甲氨基硫脲对微生物的抑菌效果
壳聚糖缩乙酰2，3 -二氟苯甲氨基硫脲对7种微生物抑菌效果见表4。
由表4可知，壳聚糖缩乙酰2，3 -二氟苯甲氨基硫脲对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、核盘菌、水稻纹枯病原菌、黄花枯萎病原菌、青霉、黑曲霉最小抑制质量浓度分别是1.95，1.95，250.00，31.25，7.81，250.00，62.50 mg/mL。
2.5 壳聚糖缩乙酰2，4 -二氟苯甲氨基硫脲对微生物的抑菌效果
壳聚糖缩乙酰2，4 -二氟苯甲氨基硫脲对7种微生物抑菌效果见表5。
由表5可知，壳聚糖缩乙酰2，4 -二氟苯甲氨基硫脲对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、核盘菌、水稻纹枯病原菌、黄花枯萎病原菌、青霉最小抑制质量浓度分别是7.81，62.50，15.62，250，62.50，250.00 mg/mL。前期初步抑菌试验结果表明壳聚糖缩乙酰2，4 -二氟苯甲氨基硫脲对黑曲霉没有抑菌性，故未测定其最小抑菌质量浓度。
2.6 壳聚糖缩乙酰3，5 -二氟苯甲氨基硫脲对微生物的抑菌效果
壳聚糖缩乙酰3，5 -二氟苯甲氨基硫脲对7种微生物抑菌效果见表6。
由表6可知，壳聚糖缩乙酰3，5 -二氟苯甲氨基硫脲对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、核盘菌、水稻纹枯病原菌、黄花枯萎病原菌、青霉、黑曲霉最小抑制质量浓度分别是250.00，1.95，250.00，7.81，1.95，62.50，62.50 mg/mL。
3 结论
含氟低聚壳聚糖衍生物对受试菌种最小抑菌质量浓度见表7。
由表7可知，不同含氟低聚壳聚糖衍生物对不同微生物的抑菌活性表现出不同程度的抑菌性。6种含氟低聚壳聚糖衍生物中，除了化合物5对黑曲霉没有抑菌性，其他几种化合物对7种受试菌株都有不同程度的抑菌性。化合物1对大肠杆菌抑制效果较好；化合物2和化合物3对7种微生物均有抑菌性，但抑菌效果较差；化合物4对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄花枯萎病原菌抑制效果较好；化合物5对大肠杆菌抑制效果较好；化合物6对金黄色葡萄球菌、水稻纹枯病原菌、黄花枯萎病原菌抑制效果较好。
参考文献：
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