打开文本图片集
摘要：本研究旨在建立一种灵敏度高、特异性强、重复性好，能快速检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的方法。根据BVDV的E2基因保守序列，设计合成一对特异性引物，建立了检测BVDV的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。将标准阳性样品10倍梯度稀释检测灵敏度，用能感染奶牛的其它病毒做对照检测特异性，用临床样本检测重复性。结果表明，该方法与能感染奶牛的其它幾种病毒均无交叉反应，检出敏感度达4.87 × 101 copies/μL，比常规PCR检测方法高10倍。同时检测了5个规模化奶牛场送检的67份奶牛腹泻样本，其BVDV检出率为46.27%（31/67）。本研究成功建立了BVDV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法，为BVDV的快速诊断和定量分析提供了技术支撑，具有很好的应用前景。
关键词：牛病毒性腹泻病毒（BVDV）;荧光定量PCR;E2基因;检测
中图分类号：S858.23 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）12-0106-05
Abstract The experiment was conducted to establish a method to rapidly detect bovine viral diarrhea virus with high sensitivity， high specificity and good reproducibility. In the study， a pair of specific primers were designed and synthesized according to the conservative sequence of E2 gene in BVDV， and the SYBR Green Ⅰquantitative real-time PCR detection method was established. The standard positive samples were diluted 10 times gradient to detect sensitivity. The specificity was tested with other viruses that could infect the cow， and the repeatability was tested with clinical samples. The results showed that this method did not have cross-react with other cow viruses， and the detection sensitivity was up to 4.87×101 copies/μL， which was 10 times higher than that of the conventional PCR method. At the same time， 67 diarrhea samples from 5 large-scale dairy farms were tested， and the detection rate of BVDV was 46.27% （31/67）. The study successfully established BVDV SYBR Green Ⅰ quantitative real-time PCR detection method， and provided technical support for the rapid diagnosis and quantitative analysis of BVDV. It would have a better application prospect.
Keywords Bovine viral diarrhea virus （BVDV）; Quantitative real-time PCR; E2 gene; Detection
牛病毒性腹泻（bovine viral diarrhea， BVD）又称牛病毒性腹泻-黏膜病（bovine viral diarrhea-mucosal disease， BVD - MD），是由牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus， BVDV）引起的一种急性传染病[1]。感染牛病毒性腹泻病毒，轻则腹泻、发热、口腔及消化道粘膜发炎糜烂，重则可导致怀孕母牛流产、死胎、犊牛持续感染甚至死亡[2]。BVDV除感染牛外，还可感染猪、鹿、羊、骆驼、兔及其他野生动物，宿主相当广泛[3]。随着规模化养殖业的迅猛发展，BVDV的流行规模也在不断加大，呈世界性分布，给畜牧业造成了巨大损失[4]。该病的防控方法中，有效检出并及时淘汰是净化畜群的重要手段[5]。因此，建立高效准确的检测方法，对该病的临床诊断、检疫、流行病学调查、净化及防治提供了有效的技术手段。
目前，牛病毒性腹泻-粘膜病的实验室检测方法主要有病毒的分离和鉴定[6]、免疫荧光试验[7]、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）[8]、微量血清中和试验[9]、抗原捕获酶联免疫吸附试验[10]和常规PCR方法[11]等。这些方法都各有其自身的优点和适用性，但又存在缺陷。本研究利用BVDV的E2基因保守序列[12]设计引物，建立牛病毒性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法，以期提高检测的准确性、敏感性和特异性，为简便省时、适于大规模 BVDV 感染的病原流行病学调查和BVDV临床诊断、实验室基础研究提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 毒株和样品来源
牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛肠道病毒（bovine enterovirus，BEV）、牛副流感3型病毒（bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）、牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus，BEFV）等相关病毒核酸，均为山东省农业科学院奶牛研究中心疾病研究室保存。临床检测样品来自2019年山东省、江苏省、天津市的5个规模化牧场送检样品。
1.2 主要试剂与仪器
SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒和病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司;Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪，罗氏公司;2×Easy Taq PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司;pClone 007 Blunt Vector Kit，购自北京擎科生物技术有限公司。
1.3 引物的设计与合成
参考GenBank中牛病毒性腹泻病毒的全基因组核酸序列，设计特异性扩增BVDV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR引物，由北京擎科生物技术有限公司合成，引物序列如表1所示。
1.4 病毒RNA提取和cDNA合成
取200 μL BVDV病毒原液，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取BVDV病毒基因组RNA，然后按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。
1.5 阳性标准品的制备
以提取的BVDV病毒基因组cDNA为模板，BVDV-F/R为引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收目的片段，连接至pClone 007载体，鉴定正确的重组质粒作为阳性标准品，命名为pClone 007-E2。测定质粒浓度，按照以下公式转换成质粒的拷贝数： 拷贝数=质粒浓度×10-9×6.02×1023/（660×质粒长度），将pClone 007-E2质粒进行10倍倍比稀释，放于-20℃冰箱备用。
1.6 建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法
以pClone 007-E2质粒为模板，采用方阵法对引物浓度（5～20 pmol/L）、退火温度（55～62℃）进行摸索，最终选取Ct最小值、荧光最高值、熔解曲线特异性明显的PCR反应条件。
采用优化完成的反应条件，以10倍梯度稀释后的阳性标准品pClone 007-E2为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，根据Ct值绘制标准曲线。
1.7 敏感性试验
以稀释后的标准品为模板，阴性对照以ddH2O为模板，进行BVDV的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR扩增，每个浓度的标准品做3个样本检测。同时相同浓度下进行常规PCR试验，分析对比两种方法的敏感性。
1.8 特异性試验
用已建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR反应体系，分别以BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV的基因组作为模板，并以ddH2O为阴性对照，分析该方法的特异性。
1.9 重复性试验
分别取等量的4份不同拷贝（4.87×103 copies/μL，4.87×104 copies/μL，4.87×105 copies/μL，4.87×106 copies/μL）的pClone 007-E2重组质粒进行荧光定量PCR检测（同时设置空白对照），每份拷贝样品做3个重复，进行批内重复性试验，通过计算 Ct值的标准差（S）和变异系数（CV）验证荧光定量 PCR的批内重复性。另外，取以上4份样品，在同一反应条件下间隔7 d重复一次独立的荧光定量PCR检测，共重复3次，然后计算 Ct值的变异系数（CV），验证此方法的批间重复性。
1.10 临床样品的检测
采用本试验建立的 IBRV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法检测5个规模化奶牛场送检的67份奶牛腹泻样品，同时利用普通PCR进行检测，比较二者的检出率，并计算二者的符合率。
2 结果与分析
2.1 质粒标准品的鉴定
以BVDV基因组cDNA为模板，利用特异性引物BVDV-F和BVDV-R进行PCR扩增，得到约185 bp左右的目的片段，与预期片段大小相同，无其他非特异性条带，阴性对照无条带（图1）。将目的基因进行回收，然后连接至pClone 007载体上。提取质粒进行测序，测序结果与NCBI登录的标准序列对比，片段插入位置正确，同源性为100%，表明标准质粒pClone 007-E2构建成功。pClone 007-E2的质粒浓度为112 ng/μL，总长度为2 096 bp，经计算拷贝数为4.87×1010 copies/μL。
2.2 SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR方法的建立
用优化后的反应条件建立标准曲线，其斜率为-3.1389，截距为30.19，相关系数为0.9931（图2），说明Ct值与10倍梯度稀释后的阳性标准品之间有良好的线性关系。
SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测 BVDV的熔解曲线显示，质粒标准品均出现了单一波峰，而阴性对照未出现熔点峰（图3），表明试验过程中没有出现引物二聚体及污染现象，且该引物为特异性扩增。
2.3 特异性试验
用建立的 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量 PCR 方法对BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O进行检测，发现只有BVDV检测为阳性（图4），说明该方法有很强的特异性。
2.4 敏感性试验
将标准质粒pClone 007-E2作10倍梯度稀释，用该方法对 4.87×107 copies/μL至 4.87×100 copies/μL的标准质粒样品进行荧光定量PCR检测。由图 5可知，该方法检出核酸的最低模板拷贝数为4.87×101 copies/μL。常规 PCR能检出的核酸最低阳性质粒拷贝数为4.87×102 copies/μL（图 6）。结果表明，本试验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的敏感性高于普通 PCR检测方法。
2.5 重复性试验
重复性试验结果（表2）表明，批内变异系数为0.07%～0.33%，批间变异系数为0.54%～0.71%，表明该方法具有良好的批内、批间重复性。
2.6 临床样本检测
采用建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测了5个规模化奶牛场送检的67份奶牛腹泻样品，BVDV阳性31份，阳性检出率为46.27%（31/67），而普通PCR 阳性检出率为43.28%（29/67），符合率为106.90%。
3 讨论与结论
牛病毒性腹泻病毒可引起患病牛呈现发热、流涎、下痢、结膜炎、口腔黏膜糜烂溃疡，孕牛出现流产、死胎和胎儿畸形，还会引起牛的免疫抑制以及持续性感染等问题[13]。牛病毒性腹泻病毒在世界范围内广泛流行，是影响养牛业健康发展的最重要疫病之一[14]。由于持续感染，牛可以长期带毒排毒，是非常危险的传染源[15]。因此，关于牛群的检测、监测与淘汰对于牛病毒性腹泻的控制非常重要。
本研究建立的牛病毒性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法不仅兼具特异性好、敏感性高和重复性好等优点，而且操作简单，易于进行大规模样品检测。此外，利用本方法检测的样品采样方便，可直接检测病原，为BVDV感染的早期诊断及病原流行病学调查提供了有效可靠的技术手段。
本研究通过对NCBI上收录的多个BVDV序列进行比对，针对E2基因上的保守区域设计特异性引物，建立了SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法。用该方法检测BVDV，最低检测限为4.87×101 copies/μL，敏感性比常规PCR高10倍;检测IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O等均为阴性，只有检测BVDV的结果为阳性，说明该方法的特异性强;批内变异系数为0.07%～0.33%，批间变异系数为0.54%～0.71%，表明该方法重复性高。用建立的荧光定量PCR方法对山东、江苏和天津3个地区5个不同牛场的67份牛腹泻样品进行检测，结果表明，建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法阳性样本检出准确率高于常规PCR方法。
本试验建立的牛病毒性腹泻病毒E2基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法可以高效、准确地确定牛群中是否存在BVDV感染，为今后BVDV的防控和净化提供了有效的技术手段，也为BVDV的实验室研究提供了参考和理论支撑。
参 考 文 献：
[1] Li X P， Zhou W G， Guan P Y， et al. Research progress on pathogenesis of bovine viral diarrhoea virus[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine， 2018.
[2] Moennig V， Becher P. Control of bovine viral diarrhea[J]. Pathogens， 2018， 7（1）：29.
[3] 陆春明， 鄢志刚， 王建. 上海嘉定、崇明地区奶牛病毒性腹泻血清学调查研究[J]. 兽医导刊， 2018（9）： 73-75.
[4] Wernike K， Gethmann J， Schirrmeier H， et al. Six years （2011—2016） of mandatory nationwide bovine viral diarrhea control in Germany—a success story[J]. Pathogens， 2017， 6（4）：50.
[5] 肖盛中， 周子恒， 马振国， 等. 牛病毒性腹泻病毒重组E0蛋白间接ELISA方法的建立及临床应用[C]//中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十四次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会第二十三次学术研讨会、中国实验动物学会实验病理学专业委员会第三次学术研讨会、中国兽医病理学家第三次学术研讨会论文集. 2018.
[6] 钟发刚， 王新华， 沈敏， 等. 牛病毒性腹泻病毒野毒株的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报， 2000， 22（6）：463-464.
[7] 赵丹， 王建华， 王万骞. 牛病毒性腹泻-粘膜病的检测技术研究进展[J]. 检验检疫学刊， 2014， 24（5）：68-70.
[8] 王姝. 牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及IPMA方法的建立与初步应用[D]. 哈尔滨：东北农业大学， 2013.
[9] 栗铭谏， 尹安娜， 赵彩娜， 等. 牛血清中牛病毒性腹泻/粘膜病毒抗体检测的初步分析[J]. 甘肃畜牧兽医， 2004， 34（6）：6-8.
[10] 罗长保， 林志雄， 鱼海琼， 等. 应用酶联免疫吸附試验检测牛病毒性腹泻-黏膜病病毒[J]. 中国兽医杂志， 2002， 38（4）：44.
[11] 王伟利， 肖成蕊， 孟日增， 等. 牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报， 2007， 29（10）：806-809.
[12] Grigera P R， Marzocca M P， Capozzo A V E， et al. Presence of bovine viral diarrhea virus （BVDV） E2 glycoprotein in VSV recombinant particles and induction of neutralizing BVDV antibodies in mice[J]. Virus Research， 2000， 69（1）：3-15.
[13] 格松. 青海省玉树地区牛病毒性腹泻病的血清学调查[J]. 中国动物保健， 2016， 18（7）：10-11.
[14] 王国超， 白鸽， 王选， 等. 牛病毒性腹泻-黏膜病研究概述[J]. 动物医学进展， 2016， 37（10）：108-111.
[15] 杨立新. 牛病毒性腹泻病毒p80蛋白单抗制备与表位鉴定及LJ36/14毒株的分离鉴定[D]. 北京：中国农业科学院， 2016.