摘要以从蝴蝶兰茎腐病斑分离的12株革兰氏阴性菌和2株真菌为试验材料，研究香茶菜属植物中2种二萜（leukamenin E和weisiensin B）以及2种三萜（熊果酸和2α羟基熊果酸）的抑菌活性，并对leukamenin E抑制病原菌尖镰孢生长的机理进行初步研究。结果表明，leukamenin E对2株真菌的抑制作用最强，熊果酸和2α羟基熊果酸次之，weisiensin B最弱；800 μmol/L leukamenin E 可破坏尖镰孢菌丝体细胞内微丝结构，并使菌丝细胞膜通透性显著增加，导致菌丝体极性生长受阻。4种萜类对12株细菌的抑制活性显示了明显的选择性和互补特性，leukamenin E对其中5种细菌有抑制作用，而weisiensin B则对其他4种细菌具有抑制活性，weisiensin B还对2种三萜均无抑制效应的细菌也有较强的抑制活性，揭示了香茶菜植物萜类分子结构多样性具有重要的化学生态学意义。
关键词对映贝壳杉烷二萜；乌苏烷型三萜；蝴蝶兰茎腐病；尖镰孢；抑菌活性
中图分类号:S 436.81文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2014.03.007Antibacterial activity and related mechanism of four terpenoids on the
pathogen of Phalaenopsis amabilis stem rotDing Lan,He Miao,Wang Baoqiang,Liu Guo’an（College of Life Sciences, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China）AbstractIn this study, twelve Gramnegative bacteria and two fungi from Phalaenopsis amabilis stem rot were tested to evaluate the antibacterial activity of the entkaurane diterpenoids（leukamenin E and weisiensin B）and the triterpenes (ursolic acid and 2αhydroxy ursolic acid). In addition, the antibacterial activity of leukamenin E to Fusarium oxysporum was preliminarily studied. The results showed that the antibacterial activity of leukamenin E was the strongest to the two fungi, while that of weisiensin B was the weakest and the two triterpenes had moderate activity. Leukamenin E at 800 μmol/L could destroy the Factin cytoskeleton of F. oxysporum, and make the cell membrane of F. oxysporum magnify obviously, resulting in hindered growth of mycelium polarity. The antibacterial activity of the four terpenoids showed obvious characteristics of selectivity and complementarity on twelve bacteria. Leukamenin E had antibacterial activity to five bacteria, while weisiensin B had antibacterial activity to other four bacteria. Weisiensin B had the antibacterial activity to the bacteria that were insensitive to two kinds of triterpenes. The test revealed that the diversity of molecular structure of terpenoids from Isodon plants had important significance in chemical ecology.
Key wordsentkaurane diterpenoid;ursane triterpense;Phalaenopsis amabilis stem rot;Fusarium oxysporum;antibacterial activity香茶菜属植物在我国共有90种、25变种，植物资源非常丰富。该属植物除了具有良好的抗肿瘤作用之外［1］还显示了对30余种人致病细菌具有较强的抑制作用［24］，以提取物为主要成分的消炎利喉药用品已上市出售；不仅如此，显脉香茶菜和蓝萼香茶菜的茎叶提取物对多种植物病原菌也有较强的抑制活性［57］，其中从显脉香茶菜分离得到的6种对映贝壳杉烷二萜均对黄瓜疫霉菌具有极显著的抑制作用［5］，这显示了进一步研究开发植物源农药的价值和潜力。研究证实，对映贝壳杉烷二萜及三萜化合物是香茶菜属植物的主要次生代谢产物［89］，迄今从该属植物中已发现该类二萜500多种［8］，三萜10余种［9］。本课题组对多种香茶菜属植物的化学成分进行了系统研究［1012］，尽管每种香茶菜中含有约10余种萜类化合物，但仅有1种二萜和2种三萜（熊果酸和2α羟基熊果酸）在含量上占绝对优势，这3种化合物的总含量占分离化合物的90%以上，测定这些高含量萜类抑制植物病原菌的能力是确定提取物中的有效成分及植物农药质量控制的重要基础。
40卷第3期丁兰等：4种萜类化合物对蝴蝶兰茎腐病菌的抑制作用及机理的初步研究2014花卉、蔬菜等在保护地种植具有高密度及高温、高湿的环境特点，极易发生病害，常年高频率使用各种化学合成农药已成为无奈之举［13］。尤其是温室的高温和密闭性，使喷雾的农药难以消散，对从业人员健康伤害大；同时，大量农药残余也会给土壤、水体等生态环境带来严重污染。亟待研究开发环境友好型植物源农药。蝴蝶兰的产业化种植过程中由于种植密度高，苗期生长环境温度高、湿度大，因此真菌［1415］、细菌［16］和病毒［17］危害严重，给蝴蝶兰产业造成了巨大的经济损失，大量使用的化学合成农药有五氯硝基苯、福美双及敌磺钠等［18］。本研究选择蝴蝶兰茎腐病为受试对象，从蝴蝶兰茎腐病灶分离感染细菌和真菌，以它们为受试菌株，研究甘肃产总序香茶菜和维西香茶菜中2种对映贝壳杉烷二萜和2种三萜的抑菌能力，并探索高活性化合物的抑菌机制，为防治蝴蝶兰茎腐病的植物源农药的研制提供科学依据。
1材料和方法
1.1试验材料
1.1.1供试菌种
分离自蝴蝶兰茎腐植株的细菌和真菌。
1.1.2供试药物
对映贝壳杉烷二萜：leukamenin E和weisiensin B；乌苏烷型三萜：熊果酸（ursolic acid）和2α羟基熊果酸(2αhydroxy ursolic acid)，均由本实验室从甘肃产总序香茶菜［Rabdosia racemosa（Hemsl.）Hara］和维西香茶菜（Rabdosia weisiensis C. Y. Wu）中分离得到［1920］，纯度达99%以上。
1.2试验方法
1.2.1蝴蝶兰茎腐病原菌的分离与鉴定
病原细菌采用画线分离法［21］。选择蝴蝶兰茎腐植株，切留病斑茎段，流水冲洗后用75%乙醇浸泡1 min，再用0.1%升汞表面消毒8 min，无菌水换洗3次后将组织研碎，无菌水浸泡60 min，使细菌释放至水中。用接种环蘸取浸泡液在细菌培养基平板表面画线，于（27±1）℃恒温培养2 d，挑出单个菌落再画线培养，如此反复多次，得纯化菌落。观察各菌落形态并进行革兰氏染色［21］。
病原真菌的分离采用组织分离法［22］。用解剖刀从蝴蝶兰茎腐茎段的病斑边缘（病健交界处）切块（0.5 cm×0.5 cm），表面消毒后（见上述细菌分离的消毒法），移至孟加拉红培养基平板上，于28 ℃恒温培养3～4 d，用接种针挑取尖端菌丝于新培养基中，28 ℃恒温培养3～4 d，若无杂菌生长，即得病菌纯菌种。
真菌形态特征观察采用插片法［21］。用无菌镊子取无菌盖玻片，以45度角插于真菌培养基平板上，从试管斜面挑取少量孢子接种于盖玻片与培养基交界处，待长出菌丝后将盖玻片于显微镜下观察菌丝体和孢子的形态。按照魏景超［23］和中国科学院微生物研究所《常见与常用真菌》的分类特征［24］比较鉴定。
1.2.2蝴蝶兰茎腐病原菌的确定
将出瓶生长6个月的健康蝴蝶兰幼苗用作回接试验材料。75%乙醇将幼苗茎部表面消毒后用无菌水冲洗，无菌条件下用灭菌针刺伤茎的基部表皮1～2 mm，用1.2.1中分离纯化的真菌进行接种［15］，每组3株苗，2组重复。置于28 ℃气候箱中培养并观察培养结果。
1.2.34种萜类化合物的抑菌活性测定
1.2.3.1对蝴蝶兰茎腐病分离细菌的抑制作用
采用麦氏浊度法确定菌悬液浓度［25］，将制备好的菌悬液摇匀后，取100 μL加到已制好的平板上，用无菌玻璃棒涂布均匀，再用无菌镊子取直径为6 mm的灭菌滤纸片浸于不同浓度的药液中至其浸润饱和，将含药滤纸片贴在平板上，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，用十字交叉法测定抑菌圈大小，抑菌圈直径小于10 mm为不敏感，抑菌圈直径10~15 mm为中度敏感，抑菌圈直径大于15 mm为高度敏感。3次独立试验。
1.2.3.2对蝴蝶兰茎腐病原菌的抑制作用
将高压灭菌后的真菌培养基冷却至50 ℃左右时加入药物母液（对照加0.5 mL无菌水），摇匀，制成不同浓度含药平板。用打孔器沿已活化的真菌平板边缘打制直径6 mm的菌饼，将菌饼接种在含药平板中央，每皿一块，每处理3个重复，置28 ℃恒温培养箱中培养3 d后，用十字交叉法测菌落直径（测量值-6 mm），计算相对抑菌率。
相对抑菌率（%）=［（对照组菌落直径-药物组菌落直径）/对照组菌落直径］×100。
1.2.4leukamenin E抑菌机理的初步研究
1.2.4.1leukamenin E对尖镰孢形态及微丝的影响
参照Gupta的方法［26］，略有改动。将平板边缘生长有菌丝的琼脂培养基切成条状小块，接种到覆盖于OM培养基［27］表面的透析膜（1.0 cm×3.5 cm）上，28 ℃下生长约2 d后，将长有菌丝的透析膜剪下，置于含有800 μmol/L leukamenin E 的OM液体培养基上培养，取培养2、3和5 h的部分菌丝于油镜下观察拍照；另取培养3 h和5 h的部分菌丝用4%甲醛固定30 min，PEM（pH7.0）缓冲液洗5次，微丝封闭液（0.2%Triton X100和0.1%BSA的PBS溶液）室温封闭1 h，滤纸吸干，用FITCPhalloidin染色60 min，PEM洗涤5次，采用Leica DMI 4 000B 荧光显微镜，油镜下观察。以10 μg/mL特异性微丝组装抑制剂——细胞松弛素B（cytochalasin B）处理1 h为阳性对照。
1.2.4.2leukamenin E对尖镰孢细胞膜通透性的影响
另外，将已活化的菌丝置于凹玻片上，加100 μL 800 μmol/L leukamenin E的OM液体培养基，对照组菌丝用等量OM液体培养基，放置于湿盒培养2 h后，用碘化丙锭（PI）染色5 min，在Leica DMI 4 000B荧光显微镜下观察拍照。
2结果与分析
2.1蝴蝶兰茎腐病原菌的分离与鉴定
从蝴蝶兰茎腐植株病斑处分离得到12株疑似感染细菌X1～X12，菌落基本形态见表1。所分离到的大部分细菌菌落较小，表面湿润，边缘整齐，而其隆起程度和颜色差异较大；通过革兰氏染色鉴定，12株细菌都是革兰氏阴性菌，且均为杆菌。表1从蝴蝶兰茎腐病分离细菌的菌落形态
Table 1The colonial morphology of bacteria separated from Phalaenopsis amabilis stem rot菌种编号 Species number大/小 Large/small干/湿 Dry/wet隆/平 Ridgy/flat颜色 Color边缘形状 Edge shapeX1小 Small湿 Wet隆 Ridgy淡黄 Faint yellow整齐 NeatX2小 Small湿 Wet隆 Ridgy无色Colourless整齐 NeatX3小 Small湿 Wet隆 Ridgy橙黄 Orange整齐 NeatX4小 Small湿 Wet隆 Ridgy淡粉 Weak pink整齐 NeatX5大 Large湿 Wet平 Flat蜡黄 Sallow整齐 NeatX6小 Small湿 Wet平 Flat蜡黄 Sallow整齐 NeatX7小 Small湿 Wet隆 Ridgy无色Colourless整齐 NeatX8小 Small湿 Wet平 Flat淡橙 Weak orange细裂 RoughX9小 Small湿 Wet平 Flat淡绿 Weak green整齐 NeatX10小 Small湿 Wet平 Flat淡粉 Weak pink整齐 NeatX11小 Small湿 Wet平 Flat淡粉 Weak pink整齐 NeatX12小 Small湿 Wet平 Flat橙黄 Orange整齐 Neat
从蝴蝶兰茎腐病植株上共分离出2株疑似病原真菌（见图1）。采用插片法，观察了它们的菌丝、产孢结构及孢子的形态。图1中a，c分别为M1和M2的产孢结构；b，d分别为M1和M2的孢子形态。经形态学鉴定，M1和M2 均为半知菌类，丛梗孢目，瘤座孢科鲜色多孢族，镰孢属。M1菌落绒状，表面呈粉白色、浅粉色，菌落中央略显紫色，反面菌落中心呈暗紫色；M2菌落薄绒状，浅紫色，有白色气生菌丝区，反面菌落中央呈土色。其中M1初步鉴定为尖镰孢（Fusarium oxysporum），M2初步鉴定为腐皮镰孢（Fusarium solani）。
多篇文献报道蝴蝶兰茎腐病原菌为真菌［1415］，因此本试验将上述分离得到的2株真菌进行回接试验，结果表明，尖镰孢可引起蝴蝶兰茎腐病。
2.24种萜类化合物的抑菌活性测试
2.2.1对从蝴蝶兰茎腐病斑分离细菌的抑制作用
4种萜类对分离得到的细菌的抑菌活性见表2。在药物浓度为4 mmol/L条件下，4种萜类显示了不同的抑菌活性。2种三萜化合物比2种二萜化合物具有更广谱的抗革兰氏阴性菌的能力；2种三萜相比，熊果酸的抗菌能力高于2α羟基熊果酸，熊果酸对10种细菌有抑菌作用，其中4株菌对熊果酸中度敏感，而2α羟基熊果酸仅对7种细菌有抑制活性，其抑菌圈均小于10 mm。2种二萜中weisiensin B抗菌性稍强于leukamenin E，12株细菌中有4株对weisiensin B显示了中度或高度敏感，仅2株对leukamenin E显示了高度敏感。
图1从蝴蝶兰茎腐病斑分离真菌的产孢结构及孢子形态
Fig.1The morphology of sporulation structures and spores of the fungi separated from Phalaenopsis amabilis stem rot
非常有趣的现象是，4种萜类对10种革兰氏阴性菌的抑制活性显示了选择性和互补性。二萜weisiensin B 对4种细菌X1、X3、X5和X11显示了较强的抑制作用，但leukamenin E却对另外5种细菌X2、X6、X7、X9和X10有抑制作用；2α羟基熊果酸对X4、X7和X8没有抑制作用，但熊果酸对其却有一定的抑制效应。同样，二萜和三萜之间也显示了抑菌互补性，2种三萜对X3和X11均没有抑制作用，但二萜weisiensin B却对它们显示了较强的抑制活性。
表 24种萜类化合物对从蝴蝶兰茎腐病斑分离细菌的抑制作用1)
Table 2The antibacterial effects of four terpenoids on the bacteria separated from Phalaenopsis amabilis stem rot供试菌
Bacteria tested抑菌圈直径/ mmInhibitory zone diameterLeukamenin E Weisiensin B Ursolic acid 2αhydroxy ursolic acidX1-15.0±1.1512.5±0.519.8±0.63X232.1±0.96-10.1±0.409.2±0.50X3-18.2±0.58--X4--9.4±0.51-X5-17.0±0.8213.1±0.569.4±0.59X68.9±0.29-8.8±0.608.8±0.61X79.0±0.70-14.1±0.74-X8--8.35±0.34-X915.5±2.08-9.1±0.479.8±0.49X107.3±0.30-8.4±0.508.3±0.61X11-12.5±0.71--X12--8.2±0.608.5±0.16
1) 4种萜类化合物的浓度均为4 mmol/L。
The concentrations of the four terpenoids are 4 mmol/L.
2.2.24种萜类化合物对蝴蝶兰茎腐病菌的抑制作用4种萜类化合物对2株真菌的抑制活性见表3。4种萜类的抑菌活性有较大差异，二萜leukamenin E对受试2种真菌的抑制作用最强，400 μmol/L时的抑制率分别为为50.5%和 66.5%。熊果酸和2α羟基熊果酸次之，weisiensin B最弱。
2.3leukamenin E抑制尖镰孢生长的机理
2.3.1对尖镰孢形态及微丝的影响
800 μmol/L leukamenin E处理尖镰孢菌丝2～5 h后，菌丝形态如图2a~d所示。对照组菌丝光滑，粗细一致，原生质体均匀透亮；处理组在2 h时菌丝尖端开始膨大形成囊泡状；3 h时菌丝折光性降低，变得粗糙，原生质开始出现断裂现象，在距菌丝顶端囊泡下2~3 μm处出现分叉状，菌丝变细扭曲（图2c）；5 h时少量菌丝尖端形成空泡（图2d）。
表34种萜类化合物对从蝴蝶兰茎腐病斑分离真菌的相对抑制率（3 d）
Table 3The relative inhibition rates of the four terpenoids against the fungi separated from Phalaenopsis amabilis stem rot（3 d）供试菌
Fungi tested相对抑制率/% Relative inhibition rate Leukamenin E800 μmol/L400 μmol/LWeisiensin B400 μmol/LUrsolic acid 400 μmol/L2αhydroxy ursolic acid400 μmol/LM157.0±1.1950.5±1.128.5±0.3615.87±0.4212.7±0.57M272.5±1.8066.5±1.9213.2±0.3413.5±0.1826.2±0.45
荧光染料FITC标记的鬼笔环肽（phalloidin）常被用于细胞骨架微丝蛋白的染色。它对细胞染色的结果见图2g~j，对照组菌丝体荧光分布均匀，表明菌丝体细胞内微丝均匀分布于胞质内（图2g）；800 μmol/L leukamenin E 处理组菌丝体内的微丝荧光形成截断，表明细胞内丝状微丝断裂(图2h~i)。与阳性对照细胞松弛素B处理组出现的断裂现象（图2j）类似，进一步证实，leukamenin E可通过损伤菌丝体细胞内微丝结构影响尖镰孢的生长。
图2Leukamenin E（800 μmol/L）对尖镰孢菌丝形态、胞质内微丝及菌丝膜通透性的影响(×400)
Fig.2The effects of leukamenin E（800 μmol/L）on mycelial morphology, Factin cytoskeleton
and mycelial biomembrane permeability of Fusarium oxysporum（×400）
2.3.2碘化丙锭染色观察二萜leukamenin E对尖镰孢细胞膜通透性的影响荧光染料碘化丙锭（PI）可与核酸特异结合，在450～490 nm激发光照射下会发射出波长520 nm 左右的红色荧光。由于PI本身不能透过生物膜，荧光显微镜下仅能观察到对照组菌丝体极微弱的红色荧光；随着细胞膜通透性增大，菌丝体红色荧光也随之增强。从图2e~f可以看出，对照组菌丝几乎不被PI染色，但800 μmol/L的leukamenin E处理2 h时绝大部分尖镰孢菌丝被染成红色，说明处理组菌丝体细胞膜结构受到较大损伤，从而极大地改变了其通透性。
3讨论
植物病原菌对植物组织的侵染经历了侵入、菌大量繁殖、寄主细胞结构损伤到坏死的复杂过程。同时，环境中的弱致病菌会因细胞结构的破坏形成次级感染，加速病情发展［28］。因此，对于植物病害的防治除了对植物病原菌进行杀灭之外，对引起次级感染的病菌最好也有抑制作用。
本文从蝴蝶兰茎腐病斑分离得到12株细菌和2株真菌（其中1株为病原菌），测试了来源于甘肃产总序香茶菜和维西香茶菜的4种萜类化合物对它们的抑制活性。 2种二萜leukamenin E与weisiensin B具有相似的分子结构，两者同为C20未氧化型对映贝壳杉烷二萜，不同之处仅在于前者的C3有一个乙酰基，而后者的C18有一个醛基［1920］； 2种乌苏烷型三萜熊果酸与2α羟基熊果酸也具有极为相似的分子结构，不同之处仅在于后者的C2位多一个羟基取代基。上述4种化合物显示了完全不同的抑菌效应。它们对2株真菌的抑制强弱顺序为leukamenin E＞熊果酸和2α羟基熊果酸＞weisiensin B；4种萜类对12种革兰氏阴性菌的抑制作用显示了明显的选择性和互补性特点（表2），leukamenin E完全不能抑制生长的细菌，对weisiensin B很敏感；三萜完全不能抑制生长的细菌，二萜的抑制活性很好。 由此可知，香茶菜属植物中的二萜和三萜分子结构的多样性形成了抗菌能力的多样性，揭示了植物次生代谢产物分子结构多样性的化学生态学意义，也明示了植物源农药的开发利用尽可能以使用复方途径为佳。
本文的回接试验显示蝴蝶兰茎腐病原菌为尖镰孢（Fusarium oxysporum），这与多篇文献报道［14,18］ 相一致。近年来，利用植物提取物防治尖镰孢病害已越来越受到关注［29］，苦槛蓝、石菖蒲提取物及某些药用植物的混配物对尖镰孢显示了较强的抑制作用［3032］。4种萜类中二萜leukamenin E对尖镰孢的抑制活性最强，进一步研究发现，测试浓度下该化合物可破坏尖镰孢菌丝体细胞内微丝，并使细胞膜通透性显著增加。真菌菌丝的生长是基于细胞骨架的菌丝顶部极化的胞吐作用和胞质膨压，将胞质推向柔韧的顶端细胞壁［33］，而菌丝顶端的微丝骨架系统主导了细胞质的向顶运动和细胞壁泡囊的分泌和运输过程［34］。因此，二萜 leukamenin E对微丝正常结构的破坏中断了菌丝细胞生长物质运输载体——泡囊的向顶运输，这是导致尖镰孢菌丝形态改变和生长受阻的直接原因。至于菌丝细胞膜的通透性改变是否与微丝受损直接相关还有待进一步研究证实。
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