[摘要]目的：探讨以非降解聚氨酯弹性体支架材料体外构建残耳软骨用于修复耳廓组织的可行性。方法：分离30例临床小儿畸形患者软骨细胞，经培养、扩增后制成细胞悬液滴加于圆盘状聚氨酯支架上，体外培养21d后接种于裸鼠体内培养42d，应用扫描电镜观察细胞-支架复合物生长情况，同时使用免疫组织化学法观察成软骨细胞冰冻切片情况。结果：软骨细胞体外培养3周后形成的细胞-支架复合物的形态学及组织学较正常耳廓软骨组织相差甚远，而在裸鼠体内培养6周的细胞-支架复合物外观光滑细腻，与正常耳廓软骨组织相近，经免疫组织化学法分析可见新生的软骨组织细胞间质中存在蓝黑色的丝网状弹力纤维。结论：聚氨酯材料能够成为组织工程耳廓软骨的支架材料，且体内培养较体外培养更利于软骨组织的生长。
[关键词]非降解聚氨酯弹性体;组织工程;支架;培养;耳软骨损伤;修复
[中图分类号]R622 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2019）03-0089-04
Abstract： Objective To investigate the feasibility of constructing tissue engineered cartilage in vitro by using chondrocytes and non-degradable polyurethane elastomers as clinical scaffolds in vitro. Methods 30 cases of rabbit chondrocytes were isolated from clinical pediatric malformation. The cell suspension was added to disc-shaped polyurethane scaffold after culture and amplification after vitro culture for 21 days. They were inoculated into nude mice for 42 days. The growth of the cell scaffold complex was observed by electron microscopy. The frozen sections of osteoblasts were observed by immunohistochemistry. Results The morphology and histology of the cell-scaffold complex formed by chondrocytes cultured for 3 weeks in vitro was much different from that of normal auricular cartilage tissue， while the cell-scaffold complex cultured in nude mice for 6 weeks was smooth and delicate. Similar to the normal auricular cartilage tissue， immunohistochemical analysis showed that there were blue-black mesh-like elastic fibers in the interstitial cells of the new cartilage tissue. Conclusion Polyurethane material can be used as a scaffold material for tissue engineering auricular cartilage， and in vivo culture is more conducive to the growth of cartilage tissue than in vitro culture.
Key words： non-degradable polyurethane elastomer; tissue engineering; scaffold; culture; ear cartilage injury; repair
先天性畸形、外傷引起的耳廓软骨损伤不仅增加患者痛苦，还会影响外观，不利于患者身心健康[1]。由于耳廓软骨细胞代谢缓慢，再生能力低，因此患者耳廓软骨组织损伤后难以通过细胞自身修复达到理想的效果[2]。近年来，随着组织工程技术的发展，以可降解性的生物材料作为重建及修复软骨组织，能在一定程度上修复软骨损伤，改善软骨组织外观，但可降解支架稳定性较差，其构建的细胞-支架复合物力学性能无法持久，仍需要不断改进[3-4]。因此，本研究将探讨以非降解聚氨酯弹性体材料制成圆盘状聚氨酯支架构建组织工程软骨的可行性，旨在为耳软骨损伤患者临床修复提供指导。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 软骨组织：收集30例临床耳廓畸形患者耳软骨组织，材料由中国医学科学院整形外科医院整形七科提供，组织获取均经医学伦理委员会批准。
1.1.2 实验动物：选取军事医学科学院实验动物中心提供的雌性裸鼠5只，周龄5～6周，由中国医学科学院整形外科医院动物实验中心负责饲养。
1.1.3 材料：聚氨酯弹性体材料由中国医学科学院基础医学研究所生物医学工程系许海燕教授课题组提供;甲苯胺蓝色染色液、多聚甲醛溶液由上海生工生物工程股份公司提供;DAB显色试剂盒由北京鼎盛生物科技有限公司提供。
1.1.4 仪器：光学显微镜由美国Nikon Corporation公司提供;HM550切片机由德国Microm公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 软骨细胞培养：对残耳进行清洗消毒，剪碎至1mm3大小的颗粒，加入0.25%胰酶5ml，在37℃恒温水浴箱中振荡消化20min，弃去上清液，加入0.4%胶原蛋白酶5ml，37℃消化300min，过筛收集软骨细胞。将收集的耳软骨细胞加入10%胎牛血清培养基中，按3×10-8/L的细胞浓度接种，置于37℃恒温水浴箱中进行传代培养，收集第二代残耳软骨细胞接种于支架上。
1.2.2 细胞-支架復合物的体外及体内培养：将二代残耳软骨细胞接种在圆盘状聚氨酯支架上，随机分为3组（A、B、C），A组于接种后24h行扫描电镜观察;B组于体外培养3周后行扫描电镜观察;C组于体外培养1周后植入裸鼠体内，6周后再行扫描电镜观察。
1.2.3 实验检测： A、B、C三组软骨组织培养结束后于扫描电镜下观察软骨细胞支架结构及弹力纤维形成情况，采用10%中性福尔马林固定软骨组织24h，经石蜡包埋、脱水，制成4～5μm厚切片，依次行HE染色、番红O染色、弹力纤维染色，观察组织情况。
2 结果
2.1 软骨细胞与材料的粘附情况：软骨细胞接种24h后，扫描电镜下可观察到圆盘状聚氨酯支架上细胞形态均匀、排列有序、接触良好，还可见支架空隙内软骨细胞密集分布，提示软骨细胞胞外基质已形成。同时在扫描电镜下还可观察到部分细胞已被基质包围，部分细胞呈完整圆形、椭圆形或梭形细胞轮廓（见图1A，1B）。而在圆盘状聚氨酯支架截面上可观察到传代软骨细胞已经浸润支架内部，但支架内部的软骨细胞密度明显低于支架表面，而且支架内部软骨细胞胞外基质还没形成或形成不明显，细胞多呈圆形分散、聚集、粘附在孔壁上，细胞间接触紧密度也不及表面软骨细胞紧密度（见图1C，1D）。
2.2 软骨细胞体外3周组织学染色情况：软骨细胞体外培养3周后，经HE染色可观察到支架表面上生长大量软骨细胞，而在孔径为200μm的支架上可见少量的软骨细胞聚集，且软骨细胞呈陷窝状（见图2A，2B），番红O染色为弱阳性（见图2C），弹力纤维染色为阴性（见图2D）。
2.3 软骨细胞体内6周组织学染色情况：软骨细胞体内培养6周后，经HE染色可观察到支架材料与软骨细胞形成软骨组织，但这种新生的软骨组织形态较差，组织陷窝，细胞排列无序，仅在孔径约200μm的孔隙中可观察到部分形态特征并不明显的软骨组织（见图3A～3C）。番红O染色显示软骨细胞为深红色，提示软骨细胞分泌了大量的酸性蛋白聚糖（见图3D）。弹力纤维染色显示软骨细胞为蓝黑色，提示细胞内部形成丝网状弹力纤维（见图3E）。
3 讨论
合适的支架是决定软骨组织体外生长的重要因素。在以往研究中，软骨组织工程支架材料主要采用生物相容性材料制作，软骨细胞沿着支架框架进行生长，而支架逐步被分解，最终构建出由软骨基质及软骨细胞形成的软骨组织[5-6]。然而，这种方法构建出来的软骨组织性能及稳定性较差，软骨组织由于缺乏支架支撑会影响组织外观及形态，由于耳廓属于人体五官组织，临床上对其外观形态要求较高，因此构建出能与自身耳廓媲美的组织工程软骨是组织工程学人员重要研究的课题[7]。从以往动物实验中可知[8-9]，采用可降解材料构建的支架会导致组织工程支架由于无法抵抗皮肤张力而坍陷，从而形成软骨组织外观。此外，利用可降解材料作为支架构建出的软骨组织会存在严重的免疫排斥反应。Tan等[10]学者认为软骨细胞框架材料宜用不可降解材料作为内撑材料，这样不仅能构建外观更为完美的软骨组织，而且能减少对种子细胞数目的要求。基于上述研究，本研究拟通过将传代培养的残耳软骨细胞接种在非降解聚氨酯弹性体材料构建的框架上，并利用体外及体内实验证明本次研究的可行性。
非降解聚氨酯弹性体材料因其具有良好的生物相容性、稳定性及优良的力学特性，近年作为再生医学材料被广泛应用于人体各器官研制中，如人体关节配件、人体血管、人体气管等等，在人体组织工程领域中发挥重要的作用[11-13]。本实验所用的非降解聚氨酯为聚碳酸型聚氨酯，具有良好的物理学及化学稳定性，能长时间稳定地存在于人体内。与目前临床上被广泛应用的膨体材料或Medpor假体相比，其在力学性能及加工特性上更具有优势。由于非降解聚氨酯弹性及柔韧性良好，可根据耳廓外形制成各种形态的支架，使软骨组织最大限度与人体耳廓接近，并在性能上满足人体耳廓要求，使临床上耳廓组织损伤完美修复成为可能[14]。
本研究结果显示，软骨细胞接种24h后，在扫描电镜下可观察到圆盘状聚氨酯支架上细胞间密切接触，并分泌细胞外基质，大量的软骨组织浸润在材料表面上，且细胞间排列有序，紧密接触，高密度的细胞接触更有利细胞间信号传递，从而更好地发挥生物学性能。进一步观察可知，软骨细胞向支架内部浸润时效果并太理想，随着软骨细胞向支架内层浸入深入，细胞数目及密度逐渐减少。这可能与支架空隙较多及贯通性有关，更多的空隙率将有助于接种的软骨细胞在支架内部弥散，有利于细胞增殖及聚集，同时也有助于软骨细胞摄取培养基营养及排除代谢产物[15]。尽管聚氨酯材料构建的支架孔径大小适合，但孔间贯通性较差，导致接种的软骨细胞无法自由地迁移及弥散，影响软骨细胞聚集[16]。因此，通过本次研究可知，采用不可降解材料作为构建软骨细胞框架时，应尽量提高孔隙率，避免阻碍软骨细胞生长及细胞间信号传递。
本研究体外组织实验发现，软骨细胞接种在支架材料3周后可观察到淡黄色的类软骨样组织，但经HE组织学染色后并没有观察到成熟的软骨细胞着色，这可能与染色及制片过程中，软骨细胞发生了脱落有关。此外，软骨细胞经番红O染色为弱阳性，弹力纤维染色为阴性，同时还可观察到支架内部细胞排列紊乱，软骨陷窝不明显，偶见成对的同源细胞。经体内培养6周后，在电镜下可观察到支架材料上出现明显的瓷白色软骨组织，同时可观察到排列规则、形态良好的软骨细胞，经HE、番红O、弹力纤维软色后细胞着色明显，而弥散不均匀的软骨细胞经HE、番红O、弹力纤维软色后并没明显变化。导致上述情况出现的可能原因，一方面与软骨细胞体内外培养时间过短有关，另一方面也与支架材料支架孔径过大、空隙率过高、贯通性等因素影响细胞间的相容性和可粘附性能有关[17]。因此，在构建软骨细胞生长框架时不仅需要注重材料的性能，同时也要考虑材料合适的孔径大小、高孔隙率及贯通性，这些因素不仅会影响软骨细胞再分化，对调节软骨组织能力有重要作用，而且还会影响软骨细胞弥散及分布，细胞间信号交流及细胞的新陈代谢。
4 结论
聚氨酯材料能够成为组织工程耳廓软骨的支架材料，且体内培养较体外培养更利于软骨组织的生长，但以后研究中还需要进一步改进其内部结构，使其更符合正常耳廓组织性能。
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[收稿日期]2018-11-04
本文引用格式：劉戈，杨庆华，张玲，等.非降解聚氨酯弹性体支架材料体外构建残耳软骨用于修复耳廓组织的可行性[J].中国美容医学，2019，28（3）：89-92.