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摘要对经甘肃口岸进境的30批菜豆 Phaseolus vulgaris种子进行了普通细菌性疫病菌的检测，利用选择性培养基MT从波兰进境菜豆种子上分离到1株细菌597，对该分离物进行菌落形态特征观察、致病性测定、16S rDNA及16S23S rDNA ITS序列分析和特异性PCR检测。结果表明，该分离物在MT培养基上菌落呈黄色、圆形、黏稠、表面光滑向外隆起、菌落周围有水解圈。分离物597接种菜豆幼苗后导致叶片枯萎，接种点干枯。结合菌落形态、16S23S rDNA ITS序列、特异性PCR检测结果，将分离物597鉴定为地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli。
关键词菜豆种子;地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种;普通细菌性疫病;鉴定
中图分类号：S 436.43， S41.31
文献标识码：A
DOI：10.16688/j.zwbh.2018101
菜豆普通细菌性疫病1893年首次被报道[1]，引起该病害的病原物有多种，其中一些菌株在培养基上可以产生褐色素，称为褐色致病菌株[2]，褐色和非褐色致病菌株作为菜豆普通细菌性疫病的致病菌曾被统称为Xanthomonas campestris pv. phaseoli[3]。随着研究的深入，Vauterin等[45]发现非褐色菌株不同于褐色菌株，因此将非褐色菌株归于X. axonopodis，成为一个新的变种，而褐色菌株也作为一个新的变种被称为褐色黄单胞菌褐色亚种X. fuscans subsp. fuscans （Xff）[6]。目前普遍认为菜豆普通细菌性疫病是由地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种X. axonopodis pv. phaseoli （Xap）和褐色黄单胞菌褐色亚种X. fuscans subsp. fuscans （Xff）所引起的。
带菌种子是菜豆普通细菌性疫病最重要的初侵染源[79]，10 000粒种子中有1粒带菌种子即可引起菜豆普通细菌性疫病的发生流行[10]。病原菌通常寄生于菜豆种子的种皮或者胚中，寄生于胚中的病原菌在种子处理中难以去除[911]，易感菜豆品种的带菌种子发芽后在种苗期即表现症状[12]，抗性强的菜豆品种即使在种苗期不表现症状，所结种子也会被感染[13]，因此带菌种子在菜豆普通细菌性疫病的流行中起着重要作用。本研究通过对进境菜豆种子中菜豆普通细菌性疫病病原菌进行检测和鉴定，以期明确进境菜豆种子中菜豆普通细菌性疫病病原菌的种类，为进出境检验检疫和制定病害防治策略提供依据。
1材料与方法
1.1供试种子样品
30份供试菜豆种子为2015年经甘肃口岸进境的菜豆种子。
1.2培养基及主要试剂
MT选择性培养基：蛋白胨10.0 g，氯化钙0.25 g，酪氨酸0.5 g，琼脂粉18.0 g，脱脂奶粉10.0 g，放线菌酮200.0 mg，氨苄80.0 mg，盐酸万古霉素10.0 mg，吐温80 10.0 mL，蒸馏水1 000 mL。
NA培养基：氯化钠5.0 g，牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂粉18.0 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH为6.6～7.2。
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，蒸馏水1 000 mL。
PCR及电泳相关试剂：PCR buffer、dNTPs、rTaq聚合酶、loading buffer购自宝生物（大连）工程有限公司，新型植物基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。
1.3病原菌的分离与培养
每份菜豆种子取100粒浸泡在300 mL 0.8%无菌生理盐水中，加入300 μL 1%吐温20，4℃静置过夜后在摇床上180 r/min室温振荡30 min。用纱布将种子滤除，10 000 r/min离心30 min，将沉淀用0.8%无菌生理盐水悬浮，1 000 r/min离心3 min，取上清液12 000 r/min离心5 min，得到的沉淀用无菌生理盐水悬浮即为测定菌液。取10 μL菌液依次稀释为10-1、10-2、10-3，均勻涂布在MT平板培养基上，置于28℃培养箱中培养4～5 d后，挑取有双水解圈的黄色菌落划线接种到新的NA培养基上纯化，挑取单菌落获得纯培养。
1.4致病性测定
分别采用喷雾接种法和茎节接种法[14]将纯培养分离物接种到菜豆幼苗上进行致病性测定。
营养土经高温高压灭菌后装在塑料花盆（24 cm×16 cm×18 cm）中，浇透水静置24 h后播种菜豆。播种后的花盆置于温度25℃，L∥D=11 h∥13 h，相对湿度85%～95%的人工气候箱中培养，待长出2片真叶后接种。
挑取长势良好的菜豆幼苗分为2组，每组4盆苗，每盆2株苗，1组采用喷雾接种，另1组采用茎节接种。每处理3次重复，对照幼苗用无菌水接种处理。采用喷雾接种时，先将培养于NA培养基48～72 h的分离物用无菌水冲洗至无菌离心管，配制成1×108 cfu/mL的菌悬液，用无菌喷壶将菌悬液喷洒到菜豆植株表面至有菌液滴落。采用茎节接种时，用灭菌牙签蘸取培养于NA培养基上48～72 h的分离物刺穿菜豆植株第一茎节，牙签与菜豆植株茎秆保持45°，刺穿后将牙签旋转两周后缓慢拔出。将接种后的菜豆苗置于人工气候箱中继续培养，每天观察植株发病情况，记录症状特点。待植株出现明显病状后，根据柯赫氏法则，取病健交界处叶片或茎秆组织进行病菌分离，将分离菌与接种物进行形态特征比较，并用PCR进行检测，完成致病性测试程序。
1.5病原物的分子生物学鉴定
1.5.1病原菌DNA的提取
将供试菌株接种到NA培养基上，28℃培养48 h后，用接种环挑取少量菌体接种于LB液体培养基中，28℃条件下150 r/min振荡培养48 h后收集菌体。提取方法参照新型植物基因组DNA提取试剂盒的提取方法并略作改进（将第一步的裂解时间延长到30 min）。
1.5.216S rDNA序列测定
根据已发表的细菌16S rDNA通用引物27F/1492R[15]对分离物基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应总体积为50 μL：10×PCR buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L引物27F、1492R各1.0 μL，5 U/μL rTaq DNA 聚合酶0.5 μL，DNA模板3.0 μL，ddH2O 32.5 μL。PCR反应条件为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸2 min，35个循环;72℃延伸10 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，测序工作委托金唯智生物科技有限公司完成。将测序结果在NCBI网站利用BLAST与GenBank上已经发表的基因进行序列一致性比对。
1.5.316S23S rDNA ITS序列测定
根据已发表的细菌16S23S rDNA ITS通用引物1493F/23R[16]对分离物基因组DNA进行PCR扩增，反应总体积为25 μL：10×PCR buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L引物1493F、23R各1.0 μL，5 U/μL rTaq 0.5 μL，DNA模板5.0 μL，ddH2O 13.0 μL。反应条件为：95℃预变性4 min;95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环;72℃延伸7 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，测序工作委托金唯智生物科技有限公司完成。将测序结果在NCBI网站利用BLAST与GenBank上已经发表的基因进行序列一致性比对，选取同源性较高的模式菌株的16S23S rDNA ITS基因序列作为参比对象，采用ClustalX （1.83）软件进行多序列匹配排列，用系统发育分析软件MEGA 6.0的邻接法（neighborjoining）构建系统发育树，进行1 000次Bootstrap检验计算系统树中节点的置信度。
1.5.4特异性分子鉴定
利用对地毯草黄单胞菌菜豆变种和褐色黄单胞菌褐色亚种具有特异性的引物X4c/X4e、褐色黄单胞菌褐色亚种特异性检测引物Xf1/Xf2以及根据黄单胞菌属结构域蛋白序列设计的特异性引物XA3F/XA3R、XA5F/XA5R、XC9F/XC9R、XC12F/XC12R、XO4F/XO4R（表1）对分离的病原菌进行PCR检测，PCR反应总体积25 μL：10×PCR buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，5 U/μL rTaq 0.5 μL，DNA模板8.0 μL，ddH2O 10.0 μL。PCR反应条件为：95℃预变性4 min，95℃变性30 s，Tm退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环;72℃延伸7 min。其中X4c/X4e Tm=65℃，Xf1/Xf2 Tm=55℃，XA3F/XA3R、XA5F/XA5R、XC9F/XC9R、XC12F/XC12R、XO4F/XO4R Tm=59℃。
2结果与分析
2.1病原菌分离
从波兰进境的菜豆种子浸泡液中分离获得分离物597（图1），菌株597在MT培养基上（图1a）菌落呈黄色，圆形，黏稠，表面光滑向外隆起，菌落周围有1个小而模糊的吐温80水解圈和1个大而明显的酪蛋白水解圈。在NA培养基上（图1b）菌落呈淡黄色，不规则的圆形，黏稠而光滑。
2.2致病性测定
经喷雾接种和茎节接种的菜豆植株发病情况如图2所示，喷雾接菌植株接菌5 d后叶片出现坏死斑，随着接种时间延长坏死斑逐渐扩大，接种10 d后（图2b）叶片大面积枯死，植株萎蔫。经茎节接种的菜豆植株在接种4 d后，茎节处变为淡褐色，叶片开始萎蔫，接种10 d后（图2d）植株茎节变为深褐色，茎开始干枯，叶片也全部枯萎。从发病的叶片和茎节的病健交界处，取小块病样组织分离致病菌，获得的细菌分离物与接种的病菌特征一致。
2.316S rDNA序列分析
分离物597提取DNA后利用16S rDNA通用引物27F/1492R進行扩增，PCR扩增产物约1.5 kb，产物双向测序后拼接获得部分16S rDNA序列。GenBank中BLAST分析表明，分离物597的16S rDNA序列（GenBank登录号：KT374004.1）与GenBank中Xanthomonas属多个变种（包括X.axonopodis pv.phaseoli）的16S rDNA序列（CP023285.1，CP020975.1，CP017188.1，KX257179.1，CP014347.1，KM593178.1，JN109173.1，FR839635.1，AE008923.1，NR_026383.1）相似性为100%。
2.416S23S rDNA ITS序列分析
分离物597提取DNA后利用16S23S rDNA ITS通用引物1493F/23R进行扩增，PCR扩增产物约500 bp，产物双向测序后拼接获得部分16S23S rDNA ITS序列。GenBank中BLAST分析表明，分离物597的16S23S rDNA ITS序列（GenBank登录号：KX574675.1）与GenBank中X.axonopodis pv. phaseoli（CP020975.1、CP020971.1和CP020967.1）的ITS区序列相似性为100%。利用MEGA 6.0软件对GenBank中已登录的Xanthomonas属相关种的序列进行分析，采用邻接法（NJ）构建分离物597和Xanthomonasa属相关种的系统发育树（图3）。由系统发育树可见，分离物597和X. axonopodis pv. phaseoli位于同一个分支，两者亲缘关系最近。
2.5特異性分子鉴定
利用特异性检测引物X4c/X4e、Xf1/Xf2对分离物597的基因组DNA进行PCR扩增（图4），引物X4c/X4e产生730 bp左右的特异性片段;而引物Xf1/Xf2未产生目标片段。利用特异性引物XA3F/XA3R、XA5F/XA5R、XO4F/XO4R、XC9F/XC9R、XC12F/XC12R对菌株597的基因组DNA进行PCR扩增（图5），引物XA3F/XA3R未产生目标片段，而引物XA5F/XA5R、XO4F/XO4R、XC9F/XC9R、XC12F/XC12R均产生特异性片段。由于特异性检测引物X4c/X4e对X. axonopodis pv. phaseoli （Xap）和X. fuscans subsp. fuscans （Xff）均具有特异性，引物Xf1/Xf2仅对Xff具有特异性[17];引物XA5F/XA5R、XO4F/XO4R、XC9F/XC9R、XC12F/XC12R对Xap具有特异性，引物XA3F/XA3R对Xff具有特异性[18]，由此可初步判断分离物597为地毯草黄单胞菌菜豆变种。
3讨论
菜豆又称四季豆，是我国重要的豆科蔬菜作物，在蔬菜的周年供应中起着重要作用。菜豆普通细菌性疫病在世界各地主要菜豆产区均有发生，在美国[78]、加拿大[12]、欧洲[9，19]、亚洲[14]、非洲[13]均有报道。种子传播是该病害最主要的传播方式[711]。近年来，甘肃作为对外繁育种子原种进口大省，从美国、法国、德国、捷克、匈牙利、意大利、荷兰、波兰、罗马尼亚、西班牙、土耳其、俄罗斯、日本、韩国、越南、泰国、中国台湾等国家和地区进口菜豆种子数量增长迅速，种子携带细菌性病原物的几率增大。病原菌通过种子传带形成异地扩散和蔓延，将严重影响作物产量和品质，正确进行细菌性病原物的鉴定，是种子健康检测、保护育种基地安全的需要。
本研究对2015年甘肃口岸进境的30批菜豆种子进行菜豆普通细菌性疫病菌的检测，在1批波兰进境的菜豆种子中检出菜豆普通细菌性疫病菌。
目前，菜豆普通细菌性疫病主要病原菌有两种，即地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种X. axonopodis pv.phaseoli （Xap）和褐色黄单胞菌褐色亚种X. fuscans subsp.fuscans （Xff），2种病原菌具有相同的寄主范围和流行学特征[19]，除褐色黄单胞菌褐色亚种在培养条件下能够产生褐色素外，两者具有相似的生化表型[20]。利用16S rDNA和16S23S rDNA ITS序列分析及构建系统发育树是鉴定细菌的通用技术，本研究中菌株597的16S rDNA序列和16S23S rDNA ITS序列，与GenBank中地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种的相应序列具有100%的一致性。结合病原菌形态学特征、致病性测定、特异性PCR检测，证实了进境菜豆种子上的分离物597为地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种X. axonopodis pv. phaseoli，为防止病原物的传播危害提供了依据。
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（责任编辑：田喆）