摘要[目的]探讨施用钾肥对烟草青枯病的防控效果及其根际微生物群落的影响。[方法]通过田间试验研究施用不同量钾肥对烟草青枯病的防控效果及其对根际微生物群落多样性和细菌分类的影响。[结果]田间施用150 kg/hm2 钾肥时，烟草青枯病病情指数最低，土壤根际中青枯病原菌数量最少，为5.63 log CFU/g 干土，而无钾肥处理的效果最差。施钾肥提高了烟草生物量、钾含量和总酚含量。施用150 kg/hm2 钾肥能显著提高烟草根际微生物的多样性，增加益生菌Arthrobacter的相对丰度，降低了致病菌Ralstonia的相对丰度。[结论]施用适量钾肥可有效地防控烟草青枯病，提高根际微生物的多样性和有益菌的相对丰度，降低致病菌的相对含量。
关键词 烟草青枯病；钾肥；病情指数；根际微生物群落
中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）22-0125-03
Abstract[Objective]To explore the effect of application potassium fertilizer on tobacco bacterial wilt and its effect on rhizosphere microbial communities.[Method]The field experiment was conducted to study effects of different amounts of K fertilizer on tobacco bacterial wilt and its rhizosphere microbial communities.[Result]When the amount of K was 150 kg/hm2 in the field trial， the disease index of tobacco bacterial wilt was the lowest， and the number of Rhizoctonia in soil rhizosphere was the least which was 5.63 log CFU/g of dry soil， but the no K fertilizer addition treatment was the worst. The application of K fertilizer could increase the biomass， K concentration and total phenol content of tobacco. The application of 150 kg/hm2 K fertilizer could significantly increase the diversity of rhizosphere microorganisms， increase the relative abundance of probiotic Arthrobacter and reduce the relative abundance of Ralstonia.[Conclusion]The application of appropriate K fertilizer can effectively control tobacco bacterial wilt in field experiment， improve the diversity of rhizosphere microorganisms and the relative abundance of beneficial bacteria， reduce the relative content of Ralstonia.
Key words Tobacco bacterial wilt；Potassium fertilizer；Disease index；Rhizosphere microbial communities
烟草（Nicotiana tabacum L.）是我国重要的经济作物，且种植面积和产量均居世界第一位[1-2]。贵州省自然生态条件优越，适宜烟草的种植[2-3]。随着贵州省烟草种植业的发展，其地区气温高和空气湿度大的环境原因，以及烟草长期连作等因素，容易造成烟草病害的大面积暴发，特别是烟草的土传病害[3-4]。烟草青枯病是一种典型的土传维管束植物病害，其病原菌为茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum），烟草发病时多为一侧萎焉，叶片支脉间产生黑色的斑纹，其根系变黑腐烂，最后整株烟草叶片枯萎[1，5]。防治该病害一直是烟草种植上的难点，目前使用化学农药虽然能部分控制病害的发生和传播，但过量使用农药不但造成烟叶品质的下降，还容易造成环境污染[1，4]。因此，利用简单的施肥策略是一种环保的防治病害措施，也是农业科学家研究的热点，成为防治烟草土传青枯病害的重要途径之一。
施钾能提高植物对病害的抗性在国内外已有较多报道[6-8]。如在田间施钾肥，能有效抑制玉米茎腐病原菌在植物体内的扩展和繁殖，进而抑制病害的发生[6]；另外，喷施钾肥可以提高油菜叶片酚类物质的含量和多酚氧化酶的活性，从而降低油菜黑斑病的发病率[7]。施钾能提高植物对病害的抗性，主要功能在于钾参与植物形态学调节机制，能使植物形成厚实的细胞壁，提高木质化程度，使茎秆和叶片变厚；调控植物生长代谢机制，在钾的酶促作用下完成糖类、木质素、淀粉等物质的合成；钾还能提高酚类物质的合成速率，从而减少病原菌的入侵[6-9]。目前研究钾对植物的抗性机理主要在地上部分，而地下部根系是植物吸收营养和水分的主要器官，接触土壤微生物群落的重要区域。施钾对烟草根際微生物多样性和细菌菌落组成的影响，以及对烟草青枯病的防治效果，目前鲜见报道。笔者通过田间试验，研究不同钾肥水平对烟草青枯病的防治效果，并探索其对根际微生物多样性和细菌群落组成的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料
烟草品种为青枯病敏感品种DJY。烟草青枯病原菌为田间自然发病接种，植株发病后进行病原菌分离，鉴定病原菌为Ralstonia solanacearum。
1.2 试验地概况
试验在贵州省毕节地区烟草种植试验基地进行，土壤基本理化性状：pH 5.6，有机质11.8 g/kg，速效氮132.5 mg/kg，速效磷12.6 mg/kg，速效钾105.3 mg/kg。
1.3 试验方法
烟草移栽时间为2016年4月18日，烟草青枯病调查时间为7月28日。随机区组设计，试验为4个处理，分别为K0无钾肥；K75施用75 kg/hm2 钾肥；K150 施用150 kg/hm2 钾肥；K225施用225 kg/hm2 钾肥，钾肥为K2O。氮和磷的施用量：氮肥90 kg/hm2，磷肥P2O5 75 kg/hm2。每个处理小區面积为64 m2，设置4个重复，田间管理参照当地烟草栽培生产技术。
进行烟草青枯病调查时，按照如下病害分级：0级，全叶无病斑；1级，茎部偶有褪色病斑，或黑色条斑一侧有少数叶片萎蔫；2级，茎部有黑色条斑，但尚未达到植株顶部，或发病一侧有50%以上叶片萎蔫；3级，茎部有黑色条斑达到烟草植株顶部，或发病一侧有2/3的叶片萎蔫；4级，植株基本枯死[10]。病情指数的计算方法：[（∑各级数×该级株数）/（最高等级数×调查总株数）]×100。每个处理5个点取样调查，每个点10株，共调查50株，逐株记载病害分级。调查完叶片后随即采集叶片，取回实验室进行检测，主要测定指标包括整株生物量、钾含量、总酚含量，每个指标测定4次。
在调查完烟草青枯病后，随即采集根际土样品，每个处理随机选取5株进行根际土收集，样品一部分保存于4 ℃冰箱用于测定土壤中青枯病病原菌的数量[1]，其余保存于-80 ℃冰箱用于高通量测序。土壤微生物采用高通量测序技术，丰富度（Ace和Chao 1）和香农指数（Shannon diversity）主要采用mothur软件分析[11]。
1.4 测定项目与方法
收获的烟草样品先在105 ℃下杀青30 min，然后于75 ℃下烘干至恒重后称重；将样品粉碎，利用H2SO4-H2O2进行消煮，用火焰光度计法测定植株的钾浓度；总酚含量的测定：取1 g样品，加入5 mL 1% HCl的甲醇溶液，提取24 h，取0.l mL提取液稀释，定容至5 mL，摇匀，用分光光度计测定280 nm处OD值即为总酚含量[6]。SMSA培养基用于根际土壤中烟草青枯病原菌数量的测定[12]。
1.5 数据分析
采用Excel 2010 对原始数据进行处理，利用SAS 9.0对数据进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 不同钾肥施用量对烟草青枯病病情指数和根际土中病原菌含量的影响
从图1可以看出，施钾肥均能显著降低烟草青枯病的发生。当施钾量为K150（150 kg/hm2）时，病情指数最低，比K75（75 kg/hm2）和K225（225 kg/hm2）处理分别降低了23%和4%，无钾肥处理K0（0 kg/hm2 ）的病情指数最高。烟草根际土中的青枯病原菌，K150处理的病原菌含量最少，比K0和K75处理分别降低了30%和14%，K0处理根际土中青枯病原菌含量最高。说明施钾能有效地降低烟草青枯病的发生，同时减少了病原菌在根际土壤中的含量，但并不是钾肥施用越多，其发病程度越低。
2.2 不同钾肥施用量对烟草生物量、钾含量和总酚含量的影响
由表1可知，施钾显著提高了烟草生物量、钾含量和总酚含量。在生物量方面，K225处理的烟草生物量最高，比K0和K75处理分别提高了100%和27%，虽然K150处理的施钾肥量不是最高，但与K225处理相比无显著差异，仅降低了3%。说明钾肥不是施用量越多，烟草生物量越高，而是需要按照烟草的生长所需来提供适宜的钾肥。在钾含量方面，施用钾肥越多，叶片的钾含量越高。其中，K225处理钾含量最高，比K0、K75和K150处理分别提高了37%、28%和12%。在总酚方面，K150处理的总酚含量最高，K75和K225处理次之，K0处理最低。
2.3 不同钾肥施用量对烟草根际微生物多样性的影响
从表2可以看出，施钾提高了烟草根际微生物的多样性。在Chao 1指标上，K150处理最高，比K0和K75处理分别提高了32%和19%，虽然K225处理施钾量最高，但Chao 1 指数比K150处理下降了5%。Ace和Shannon指标有相同的趋势，K150处理烟草叶片的Ace比K0和K75处理分别提高了21%和16%， 而K225处理比K150处理降低了6%。说明施用钾肥能增加烟草根际土壤中的微生物多样性，但并不是施用钾肥越多，其微生物多样性指数越高。
2.4 不同钾肥施用量下根际细菌在属分类水平上的分析
从表3可以看出，相对丰度最高的属是Streptomyces，在各钾水平中，分别占总细菌种群的6.43%（K0）、7.53%（K75）、11.33%（K150）和10.42%（K225）。其次是Arthrobacter，在K150处理的相对丰度为8.93%，高于K0处理的4.80%、K75处理的6.39%和K225处理的8.03%。同时，K150处理能显著降低病原菌Ralstonia的相对丰度，K150处理所占总细菌数量的比例为0.73%，低于K0处理的1.32%、K75处理的1.09%和K225处理的1.13%，表明施钾肥能有效降低土壤中烟草青枯病原菌Ralstonia的丰富度，同时对细菌在属分类水平上有影响。
3 结论与讨论
研究表明，在田间施用钾肥对烟草青枯病有一定的防治效果。其中施钾肥量为150 kg/hm2时烟草青枯病的发病程度最低，病原菌在根际土壤中的含量最少。相对于其他钾肥处理，K150处理的烟草青枯病发病最轻，主要是由于施钾增加了烟草的生物量，提高了与抗病相关的总酚含量以及叶片的钾含量。同时，适当的钾肥用量，对增加烟草根际土壤微生物的多样性和益生菌有促进作用，减少了青枯病原菌在土壤中的相对丰度。
钾能提高植物对抗逆境胁迫的能力和调节植物病害发生的功能[6-7，13]。当植物受到病原物侵染时，可通过调节自身的酚类代谢来抵御病原菌的入侵，从而提高植物的抗病性[14]。研究发现，喷施钾肥能提高小麦叶片中酚类物质含量，同时增强了小麦对白粉病的抵抗能力[15]；施钾提高了棉花棉酚含量，而棉酚含量与黄萎病的发生呈负相关[16]。该研究发现相似的结果，施钾肥能显著提高植株中的总酚含量，而当施钾量为150 kg/hm2时，总酚含量最高，其烟草青枯病发病程度最低，说明适当施用钾肥可通过调节烟草的总酚含量来提高作物的抗病性。同时，施钾增加了植株的钾含量，使植物的细胞壁增厚，从而抵御病原菌的入侵[7-8，13]，该研究发现施钾肥能显著提高烟草叶片的钾含量，植株钾含量随钾肥用量的提高而升高。但钾肥用量并不是越高越好，而在钾肥用量为150 kg/hm2时，其发病严重度最低。因此，在农业措施上防控烟草青枯病的发生，在选择钾肥用量时，依据植物对养分的需求，达到植株生物量和抵抗病害的最大化利益。
施钾肥不仅能提高作物的产量和品质，还能改变土壤微生物的数量和种类，很多土传病害的发生与根际微生物区系相关[10，17]。研究发现，调控根际中的微生物群落能有效减少病原微生物的数量，从而减少病害的发生[17-18]。贾志红等[19]研究发现，施钾提高了荞麦根际土壤中细菌和放线菌的数量。该试验发现，通过施用钾肥提高了根际土壤中的微生物多样性，特别是在钾肥用量为150 kg/hm2时其多样性指数最高。研究发现，Actinobacteria的相对丰度和烟草青枯病病情指数呈负相关[10]，且发现Arthrobacter属中的一些细菌对青枯病病原菌具有拮抗能力[20]。通过细菌多样性的分类可知，施钾提高了Actinobacteria的相对丰度，其在钾肥用量为150 kg/hm2时丰度比其他3个处理的相对丰度高。这可能是富集了土壤中的益生菌，从而能有效地防控烟草青枯病害的发生。因此，提高了烟草根际微生物多样性，对应的病原菌丰度相对降低，从而获得了健康的根际环境，有利于病害的防控。同时，施钾提高作物对病害的抗性机制，钾对防治烟草病害的抗性机理有待深入探讨。
研究表明，当钾肥施用量为150 kg/hm2时，能有效地降低烟草青枯病的发病程度，其根际病原菌数量显著低于其他处理；同时提高了植株的总酚含量；也增加了根际微生物的多样性和益生菌Arthrobacter的丰度，降低病原菌Ralstonia的相对丰度。适宜的钾肥用量在农业上是一种简单可行的防治烟草青枯病发生的策略。
参考文献
[1]李想，刘艳霞，陆宁，等.综合生物防控烟草青枯病及其对土壤微生物群落结构的影响[J].土壤学报，2017，54（1）：216-226.
[2]王刚.我国烟草病虫害防治研究策略探讨[J].中国烟草科学，2003，24（4）：37-39.
[3]陈娜.施钾肥对烟草白粉病发生的防控效果[J].安徽农业科学，2017，45（3）：171-173.
[4]蒋岁寒，刘艳霞，孟琳，等.生物有机肥对烟草青枯病的田间防效及根际土壤微生物的影響[J].南京农业大学学报，2016，39（5）：784-790.
[5]郑继法，丁爱云，王智发.烟草细菌性病害识别及其综合防治技术[J].烟草研究与管理，2000（5）：26-27.
[6]李文娟，何萍，金继运.氯化钾对玉米茎腐病抗性反应中酚类物质代谢的影响[J].植物营养与肥料学报，2008，14（3）：508-514.
[7]WANG M，ZHENG Q S，SHEN Q R，et al.The critical role of potassium in plant stress response[J].International journal of molecular sciences，2013，14（4）：7370-7390.
[8]DORDAS C.Role of nutrients in controlling plant disease in sustainable agriculture：A review[J].Agronomy for sustainable development，2008，28（1）：33-46.
[9]刘晓燕，何萍，金继运.钾在植物抗病性中的作用及机理的研究进展[J].植物营养与肥料学报，2006，12（3）：445-450.
[10]WU K，YUAN S F，WANG L L，et al.Effects of bioorganic fertilizer plus soil amendment on the control of tobacco bacterial wilt and composition of soil bacterial communities[J].Biology and fertility of soils，2014，50（6）：961-971.
[11]SCHLOSS P D，WESTCOTT S L，RYABIN T，et al.Introducing mothur：Opensource，platformindependent，communitysupported software for describing and comparing microbial communities[J].Applied and environmental microbiology，2009，75（23）：7537-7541.
[12]ELPHINSTONE J G，HENNESSY J，WILSON J K，et al.Sensitivity of different methods for the detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts[J].EPPO Bulletin，1996，26（3/4）：663-678.
[13]ZRB C，SENBAYRAM M，PEITER E.Potassium in agriculturestatus and perspectives[J].Journal of plant physiology，2014，171（9）：656-669.
[14]NICHOLSON R L，HAMMERSCHMIDT R.Phenolic compounds and their role in disease resistance[J].Annual review of phytopathology，1992，30：369-389.
[15]YURINA T P，YURINA E V，KARAVAEV V A，et al.The use of physiological and biochemical parameters of plants for the estimation of the resistance to stem rust[C]//DEHNE H W，ADAM G，DIEKMANN M，et al.Diagnosis and identification of plant pathogens.Berlin：Springer Netherkands，1996：411-413.
[16]夏正俊，顾本康，吴蔼民，等.棉花品种抗黄萎病性与体内生化成分相关分析[J].植物保护学报，1994，21（4）：305-310.
[17]MAZZOLA M.Manipulation of rhizosphere bacterial communities to induce suppressive soils[J].Journal of nematology，2007，39（3）：213-220.
[18]CHAPARRO J M，SHEFLIN A M，MANTER D K，et al.Manipulating the soil microbiome to increase soil health and plant fertility[J].Biology and fertility of soils，2010，48（5）：489-499.
[19]賈志红，孙敏，杨珍平，等.施肥对作物根际微生物的影响[J].作物学报，2004，30（5）：491-495.
[20]HUANG M Y.Identification and fermentation of antagonistic bacterium against Ralstonia solanacearum[J].Microbiology China，2011，38（2）：214-220.