[摘要] 目的 探讨优化的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测试剂在流感病毒检测中的应用。 方法 选取乙型流感病毒Yamagata系细胞毒株1株对其倍比稀释，取高、中、低三个稀释浓度提取流感病毒核酸作为模板，采用具有高扩增效率的SpeedStar HS DNA聚合酶和HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase逆转录酶进行PCR反应体系优化，并用优化试剂对三个浓度的流感病毒模板进行批间和批内重复性试验，与常规试剂TaKara One Step PrimeScript RT-PCR Kit反应试剂盒进行对比研究。 结果 优化试剂的PCR反应体系整个扩增反应时间从96 min缩短至55 min；通过Ct值比较，中、低浓度条件下的扩增效率与常规TAKARA试剂比较差异有统计学意义（P<0.05）；组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；该试剂的组内试验和组间试验的变异系数均小于2%，显示其具有良好的可重复性。优化试剂比TAKARA公司One Step PrimeScript RT-PCR Kit成品试剂盒节约1/4的成本，有一定的经济效益。 结论 优化的RT-PCR反应试剂，缩短了PCR反应时间，具有良好的稳定性和重复性，同时节约了试剂检测成本，有一定的经济效益和社会推广价值。
[关键词] 乙型流感病毒；逆转录聚合酶链反应；核酸；优化
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）21-0099-04
Application evaluation on optimized RT-PCR detection reagent in influenza virus detection
GAO Lei YAN Yong JI Jimei WANG Henghui GE Zhijian
Department of Clinical Laboratory， Jiaxing Center for Disease Control and Prevention in Zhejiang Province， Jiaxing 314050， China
[Abstract] Objective To discuss the application of optimized RT-PCR detection reagent in influenza virus detection. Methods One strain of influenza B virus Yamagata was selected and multiply diluted. Three concentrations （high， middle， and low） were selected and viral nucleic acid was extracted as templates. The PCR system was optimized by SpeedStar HS DNA polymeras and HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase with high amplification efficiency. Intra-batch and inter-batch repetitive tests were conducted on the three templates by optimized reagent. The results were compared with those of routine reagent TaKara One Step PrimeScript RT-PCR Kit. Results With optimized reagent， the reaction time of PCR was shortened from 96 min to 55 min. There were significant differences in Ct values between the amplification efficiency of middle and low concentration and that of routine TAKARA kit （P<0.05）. There were significant differences in Ct values among groups（P<0.05）. The variable coefficients were lower than 2% in both intra-batch and inter-batch tests， showing good repeatability. The cost of optimized reagent was about 1/4 lower than that of One Step PrimeScript RT-PCR Kit， showing a certain economic benefit. Conclusion Optimized RT-PCR detection reagent can shorten the response time of PCR， with good stability and repeatability， and can lower the cost， showing a certain economic benefit and promotional value.
[Key words] Influenza B virus； RT-PCR； Nucleic acid； Optimization
流行性感冒（Influenza）簡称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。经空气飞沫传播、传染性强、传播迅速，因其病毒抗原易变异，且人类对变异毒株普遍易感，控制难度大，是我国重点监测和防治的传染病之一[1]。传统的实验室确诊方法是通过细胞培养或鸡胚培养分离定型流感病毒，不仅耗时长，而且技术要求高，无法及时对暴发疫情做出诊断[2]。如何在早期快速诊断分型、并对病毒变异进行长期监测，对流感的防控和临床治疗有重大意义[3-6]。随着检测技术的发展，呼吸道疾病的诊断方法也不断更新，如实时荧光定量PCR[7，8]、恒温扩增[9，10]以及基因芯片技术[11，12]等。本文应用了具有超强耐热性和延伸效率的新一代逆转录酶HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase和具有高扩增效率的SpeedStar HS DNA聚合酶，进一步优化实时荧光RT-PCR反应体系，研究其反应时间、敏感性及稳定性，为流感的快速检测提供稳定高效的方法。
1 材料与方法
1.1样本来源
MDCK细胞株B/浙江南湖/1310/2014（乙型Yamagata系）培养液，为本实验室留存，起血凝滴度为1∶128。毒株培养液经磷酸盐缓冲液（PBS）10倍倍比稀释，获得不同浓度的流感病毒培养液。选取其中10倍、104倍、107倍稀释后的培养液分别作为高浓度、中浓度、低浓度样本，分装后于-80 ℃冻存。
1.2核酸提取
将上述高、中、低三个不同浓度的流感病毒上清液，按核酸提取试剂盒（ambion MagMAX-96 Viral RNA）说明书，在KingFisher Flex system核酸提取仪（Thermo Fisher Scientific Inc.，USA）上提取流感病毒RNA。提取的核酸经检测后-80℃保存。
1.3方法
1.3.1 荧光PCR扩增 本次实验扩增所需的引物、探针均由浙江省疾病预防控制中心病毒所提供。（1）常规RT-PCR反应液配置和PCR扩增条件参照TaKara 公司 One Step PrimeScript RT-PCR Kit 试剂盒，扩增程序42℃ 30 min；95℃ 15 s；95℃ 10 s；55℃ 15 s，40个循环。（2）优化试剂：采用SpeedStar HS DNA聚合酶和HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase逆转录酶优化反应体系配置，扩增程序如下：50℃ 15 min、95℃ 10 s、95℃ 5 s、55℃ 10 s，40个循环。
1.3.2扩增效率 将上述的高、中、低浓度流感病毒毒株培养液提取的病毒核酸模板，采用优化试剂和传统TAKARA试剂分别进行PCR扩增，比较两种试剂的扩增效率。
1.3.3重复性试验 将上述高、中、低浓度流感病毒毒株培养液提取的病毒核酸模板，按优化试剂的反应条件进行组内试验和组间试验，每个稀释度的Ct值和标准差（SD）及变异系数（coefficient of variation，CV）。依据其定量结果对数值，计算不同方法的变异系数。
1.4 统计学方法
应用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCR反应时间比较
采用传统TAKARA试剂的整个PCR扩增反应时间为96 min，采用优化试剂整个PCR扩增反应时间是55 min，时间上缩短接近一半。
2.2 扩增效率比较
高、中、低三种不同浓度，分别用两种试剂进行PCR扩增的Ct值见表1。Ct值反映了模板初始浓度，是荧光信号到达要设定的阈值时所经历的循环数，同时也能反应扩增效率[13-15]。采用t检验，在高浓度条件下，两种试剂的检测结果Ct值比较，差异无统计学意义（P>0.05）；在中浓度和低浓度条件下，两种试剂的检测结果Ct值比较，差异有统计学意义（P<0.05），即优化试剂扩增效率略优于常规试剂。两种试剂检测结果Ct值组间比较，差异有统计学意义（P<0.05），即采用优化试剂检测方法优于常规试剂。
2.3重复性试验
高、中、低浓度流感病毒毒株培养液提取的病毒核酸模板，用优化试剂进行组内试验和组间试验，每个稀释度的Ct值和标准差（SD）以及变异系数（CV）见表3。3个稀释浓度的Ct值变异系数均小于2%，表明所建立的流感优化试剂的检测体系稳定，具有良好的重复性。
2.4经济效益
传统TAKARA 公司的“One Step PrimeScript RT-PCR Kit”成品试剂盒的市场价格为2420元/100个反应。本实验配置的优化试剂成本大约为1820元/100个反应，节省约1/4实验费用，有一定经济效益。
3讨论
流感具有暴发突然、扩散迅速的特点，由于短期内无法获得毒株抗体，因而不能实现血清学检测。荧光定量RT-PCR检测技术具有快速、灵敏、特异性强等优势，在流感病毒的检测领域得到了广泛的应用，双重、三重乃至多重PCR技术的应用与开发，无论是准确度还是检测效率，均得到了很大程度的提高[16-18]。
传统的检出限定量检测的方法是运用目的基因质粒标准品构建，即目标病毒PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，目标基因片段纯化回收，连接于质粒载体，经过纯化、增菌后提取重组质粒，再经过PCR和测序，鉴定重组质粒中的目标片段正确，如此测得的检出限，按照公式拷贝数=（质量/分子量）×6.02×1023，直接定量到拷贝数[19-21]，该方法优点是比较检出限定量的拷贝数值，比较准确，由质粒DNA作为标准品构建的标准曲线的稳定性和重复性更好。缺点是整个过程操作比较繁琐，耗费时间长。
本文以实验室的B型流感病毒细胞培养物直接PBS10倍稀释后的选取代表性的高、中、低浓度，用t检验比较两种方法检测高、中、低三个浓度下的Ct值有无统计学差异。结果表明在高浓度下，两个试剂扩增效率无统计学差异，而中、低浓度条件下，优化试剂扩增效率略优于常规TAKARA试剂。两种试剂检测结果Ct值组间比较也说明优化试剂优于常規试剂。优点是操作相对简便，取材也方便，也具有一定代表性。不足是Ct值是个相对数值，不如直接的拷贝数精确。
本实验主要针对PCR反应体系试剂的优化，采用了高效逆转录酶HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase，该酶可在55℃长时间反应并保持良好的稳定性，高温下保持高活性的逆转录酶使整个逆转录时间仅需15 min。同时搭配了用于快速PCR扩增的Hot Star型DNA聚合酶，普通PCR酶的延伸为1 min/kb，而使用SpeedSTAR HS DNA Polymerase延伸可设定为10 sec/kb，实现短时间内的快速PCR扩增。因而整个扩增过程比传统TAKARA的OneStep RT-PCR扩增程序节省了近一半的时间，大大提高了检测的工作效率和缩短了临床报告时间。
本实验优化试剂高、中、低3个稀释浓度的批内试验和批间试验的Ct值变异系数CV均小于2%，表明优化试剂具有良好的重复性和稳定性，这对临床诊疗和流感疫情爆发的处理尤其重要。同时，优化试剂比TaKara公司One Step PrimeScript RT-PCR Kit成品商品试剂盒节约1/4的成本实验检测费。对于加入国家流感网络实验室，需要进行长期哨点医院每周20份流感咽拭子疫情监测的实验室，也有一定经济效益，故有一定的社会推广价值。
本实验的初衷是想建立快速检测病原微生物的反应模型，提高日常工作效率，缩短反应时间，尤其是在传染病爆发的应急检测时。对于建立的体系，是否适应于其他传染病病原体，如手足口、诺如、麻疹、风疹病毒核酸的检测，还需要进一步通过实验室更多的样本进行研究和验证。
[参考文献]
[1]朱建疆，马建涛，巴依拉都·马力哈孜，等. 2010年-2015年昌吉流行性感冒和人禽流感检测结果分析[J]. 中国卫生检验杂志，2016，26（13）：1916-1918.
[2]陈棋炯，孙永祥，丁水军，等. 应用实时荧光定量PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒[J]. 中国卫生检验杂志，2010，20（6）：1394-1396.
[3]Duan W，Sun Y，Yang P，et al. Analysis on the influenza surveillance in Beijing during 2012-2015[J]. Capital Journal of Public Health，2016，10（2）：54-57.
[4]Wu CL，Yang F，Huang DN. Phyletic evolution and molecular variation of pandemic influenza A（H1N1）2009 virus in Shenzhen from 2009 to 2014[J]. International Journal of Virology，2015，22（6）：389-393.
[5]Jing HB，Zhang S，Wang P，et al. Epidemiological analiysis of nine respiratory viruses among respiratory infectiongs in Shunyi district，BeiJing[J]. International Journal of Virology，2015，22（4）：240-244.
[6]Li Y，Han GY，Lin YF，et al. Epidemiological characterisrics of influenza outbreaks in Hebei procince during 2012-2014[J]. International Journal of Virology，2016，23（1）：4-7.
[7]叶惠仪，丁妙霞，黄江志，等. 应用荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒[J]. 畜牧兽医科技信息，2015，8：44-45.
[8]Xiang L，Chen SJ，Wang X，et al.Rapid detection of four kinds of respirovirusesby real-time fluorescence quantitative RT-PCR[J].J Trop Med，2014，14：461-465.
[9]Mori Y，Kanda H，Notomi T.Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）：recent progress in research and development[J]. J Infect Chemother，2013，19：404-411.
[10]罗思思，谢芝勋，谢亚基，等.H7亚型和N9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法建立[J].畜牧兽医学报，2015，46：1176-1183.
[11]Cannon GA，Carr MJ，Yandle Z，et al.A low density oligonucleotide microarray for the detection of viral and atypical bacterial respiratory pathogens[J].J Virol Methods，2010，163：17-24.
[12]Miller MB，Tang YW.Basic concepts of microarrays and potential applicationsin clinical microbiology[J]. Clin Microbiol Rev，2009，22： 611-633.
[13]高蕾，燕勇，王恒辉，等. 基于SpeedStar HS DNA聚合酶的高速RT-PCR方法在流感病毒核酸检测中的应用[J]. 中国卫生检验杂志，2016，26（13）：1852-1854.
[14]钟江华，张光萍，柳小英，等. 实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用[J]. 氨基酸和生物资源，2011，33（2）：68-72.
[15]张振东，邹亚男，王淑芬，等. Real time PCR研究进展在海洋病原生物检测中的应用[J]. 海洋环境科学，2008， 27（2）：144-150.
[16]蒋文明，李金平，于美芳，等. 双重RT-PCR 快速检测H7N9流感病毒方法的建立[J]. 中国动物检验，2015， 32（5）：65-68.
[17]刘婷婷，谢芝勋，宋德贵，等. H3N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR檢测方法的建立[J]. 动物医学进展，2015， 36（2）：7-11.
[18]邸红芹，杨永辉，朱桂云，等. 改良多重实时荧光定量PCR检测流感A 型和B 型病毒[J]. 河北医药，2016， 38（23）：3529-3532.
[19]石伟先，张靖，孙瑛，等. 一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价[J]. 疾病监测，2016，31（11）：915-919.
[20]马光华，崔大伟，谢国良，等. 多重荧光定量RT-PCR 检测高致病性H5N6 禽流感病毒[J]. 临床检验杂志，2016，34（2）：81-84.
[21]戴玉柱，崔大伟，杨先知，等. 五重荧光定量RT-PCR 法检测甲型流感病毒[J]. 临床检验杂志，2015，33（9）：641-644.
（收稿日期：2017-04-19）