摘 要：为了给防治大果紫檀叶斑病提供理论依据，对发生于广东大果紫檀上的一种新病害——叶斑病的病原进行了形态学及分子生物学鉴定。通过观察病害症状，分离培养病原菌并观察菌落形态、产孢结构及分生孢子特征，并结合病菌DNA序列对比，最后将其鉴定为间座壳属真菌，其无性阶段为拟茎点霉属。
关键词：大果紫檀；叶斑病；病原鉴定
中图分类号：S436.64 文献标识码：B 文章编号： 1006-060X（2014）09-0047-02
大果紫檀（Pterocarpus macrocarpus Kurz）又称香红木或红花梨木，是蝶形花科紫檀属的高大落叶乔木树种，主要分布于泰国、缅甸、老挝和越南等地[1]。目前，在我国海南、广东、广西、福建和云南等地有引种栽培[2]。大果紫檀商品材名为Burma padauk，是我国珍贵红木树种中的珍品[3]。其心材桔红色、砖红色或浅黄色，有深色条纹，香气浓郁，花纹清晰，结构细匀，材质坚硬致密，不裂不翘，容易雕刻，是制作高级红木家具和雕刻精美工艺品的上等材料。
我国红木家具历史渊源，在古代，紫檀红木、花梨木常具有高贵地位的象征。但我国由于材料稀少，红木家具的生产一直受到制约。近年来，由于市场需要，红木树种包括大果紫檀的引种栽培得到了较大地发展，同时，相关的栽培技术研究也有了报道[4-6]。然而，随着引种栽培的增加，广东省大果紫檀病虫害也逐渐发生，例如炭疽病、尺蠖和刺蛾[4]。最近，又出现了一种新病害——叶斑病，且其危害有逐渐加重的趋势。为了了解该病害并对以后的防治提供理论依据，文章对大果紫檀叶斑病的病原进行了鉴定。
1 材料与方法
1.1 材 料
供试菌株从广东省肇庆市珍贵树种培育实验示范基地采集的大果紫檀发病叶片上分离纯化获得。供试培养基为PDA培养基（广东环凯微生物科技有限公司）。
1.2 方 法
1.2.1 病状观察和描述 观察发病部位，病斑的形状、大小、色泽、排列等以及病害对大果紫檀的影响（例如：枯萎、凋谢、畸形、变色和生长习性的变化）。
1.2.2 病原菌的分离与纯化 剪取发病叶片上病健交界处部分，大小为4 mm×4 mm，在无菌条件下，先于75%酒精中浸泡10 s左右，再放入0.1%升汞溶液中消毒1 min，并用无菌蒸馏水洗3～4次，然后用灭菌滤纸吸干表面的水分，接种于准备好的PDA培养基上[7]。将培养基放入28℃恒温培养箱中培养4 d，待长出菌丝后，用接种环挑取菌落边缘生长旺盛的菌丝接种到另一个PDA培养基上。重复以上操作2～3次，获得纯化的菌种，备用。
1.2.3 致病性测定 用灭过菌的打孔器（孔径为0.65 cm）将培养好的菌落打孔后，对大果紫檀的健康离体枝叶进行接种。接种前，先用水冲洗叶片表面，然后用70%酒精对叶片表面消毒，无菌水清洗3次，再对大果紫檀进行有伤（针刺伤口）和无伤接种，以打孔后的空白培养基接种作对照，将接种的叶片置于温度28℃、RH90%的人工气候箱中进行保湿培养。每日观察、记录发病情况，并对接种成功的叶片进行再分离、培养、镜检，确认病原菌。
1.2.4 病原菌的形态学鉴定 用打孔器（孔径为0.65 cm）对PDA平板上生长旺盛的菌落边缘的菌块进行打孔，再将0.65 cm的菌块移植到另一个PDA培养基中央，于28℃恒温培养箱中培养4 d，然后观察菌落及子实体的形态、颜色、大小等特征。
1.2.5 病原菌的ITS序列测定 ①基因组DNA的提取：将纯化后的菌株接种到铺有玻璃纸的PDA培养基上培养4 d，用灭菌好的铁勺轻轻刮取适量的菌丝，然后用液氮研磨采用CTAB[8]法提取DNA，并电泳检测。②DNA的PCR扩增与检测：采用真菌通用引物ITS1/ITS4（ITS1：5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），对大果紫檀菌株的DNA进行PCR扩增，反应体系为：PCR反应混合液总体积为25 μL，包括10×PCR缓冲液（含Mg2+）5 μL、dNTP4 μL、上游下游引物各1 μL（10 μM）、TaqDNA聚合酶0.5 μL、DNA模板为0.3 μL，双蒸水补足到25 μL混匀。PCR反应程序为：94℃4 min；94℃50 s、55℃50 s、72℃1 min，共30个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经琼脂糖电泳检测。扩增产物送北京奥科鼎盛有限公司测序，所得序列在NCBI上比对，下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列，用BioEdit、Clustal和MegAlign 软件采用最大相似系数法进行系统分析。
2 结果与分析
2.1 症 状
病害主要危害大果紫檀的叶片，初期主要是在叶尖或叶缘产生不规则的茶褐色病斑，病斑边缘暗褐色，有轮纹。发病后期，叶片翻卷，病斑中央密生许多黑色小点，即病原菌的子实体（见图1A）。
2.2 致病性测定结果
接种2 d后，叶片接种点出现褐色病斑，症状与自然发病的症状相同。从接种叶片病斑上分离得到的病原菌物与接种菌相同。
2.3 病原形态鉴定结果
PDA培养基上生长的菌落为圆形，边缘整齐，菌丝乳白色，生长较密，呈羽毛状，一般6 d后，菌落长满整个培养基（如图1B所示）。病原菌分生孢子较小，呈卵圆形或纺锤形，单孢，无色透明，大小为5.0～7.2μm× 1.8～2.2 μm（见图1C）。根据以上病原菌形态特征，参考魏景超[9]、陆家云[10]等研究，将病原菌初步鉴定为拟茎点霉属真菌（Phomopsis sp.）。
2.3.1 病原菌ITS序列测定结果 采用真菌通用引物ITS4进行PCR扩增，获得大小为561 bp的目的片段，经比对分析可知，病原菌TC097与拟茎点霉属和间座壳属（Diaporthe sp.）的核糖体DNA-ITS序列的相似性最高，达99%。系统进化分析结果显示（见图2），病原菌TC097与1株间座壳属菌聚于同一分支中，与其他菌株的遗传距离较远。根据分子生物学理论，将从大果紫檀树上分离出的病原菌鉴定为Diaporthe sp.。
3 讨 论
拟茎点霉属是一种重要的植物病原，其分类界定一直处于不明确状态。直到1980年，Sutton[11]给出了拟茎点霉属的定界，其主要形态学特征：分生孢子有两种类型，其中，甲型分生孢子卵圆形至纺锤形、无色、单胞，通常含两个油点；乙型分生孢子无色、单胞，顶端常成钩状或卷曲。其有性态为间座壳属，属子囊菌亚门间座壳目，其子囊壳近球形，一般具长颈，通常在一个假子座中聚集；子囊短圆柱形，顶壁厚；子囊孢子椭圆形或纺锤形、双胞、无色[12]。虽然这种病原菌未见乙型线状孢子产生，但真菌的形态特征较复杂，少数形态特征相似。而核糖体DNA内转录间隔区多态性较高，从中可以获得相对足够的信息来反映生物亲缘关系及分类情况。且间座壳属为拟茎点霉属的有性态。综合采用传统的形态学与rDNA-ITS序列分析方法，将大果紫檀叶斑病的病原菌鉴定为Diaporthe sp.。
参考文献：
[1] 王伟民，杨曾奖.珍贵红木树种—大果紫檀简介[J]. 广东林业科技，2006，22（3）：145-146.
[2] 林仰三，苏中海. 红木纵横谈[J]. 广东林业科技，1993，（3）：42-44.
[3] 陈青度，李小梅，曾 杰，等. 紫檀属树种在我国的引种概况及发展前景[J]. 广东林业科技，2004，（20）：38-41.
[4] 邹寿青，郭永杰. 大果紫檀的育苗栽培技术[J]. 林业调查规划，2008，33（5）：131-132.
[5] 陈青度，李小梅，曾 杰. 紫檀属树种在我国的引种概况与发展前景[J]. 广东林业科技， 2004，20 （2）：38-41.
[6] 曾 杰，陈青度，李小梅. 世界紫檀属树种及其在我国的引种前景[J]. 广东林业科技，2000，16 （4）：38-44.
[7] 方中达. 植病研究方法[M]. 北京：农业出版社，1998.
[8] 林加涵，魏文铃，彭宣宪. 现代生物学实验（下册）[M]. 北京：高等教育出版社，200l.
[9] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979.
[10] 陆家云. 植物病害诊断[M]. 北京：中国农业出版社，1997.
[11] Sutton B C. The Coelomycetes（First edition）[M]. CABI，1980.
[12] 戚佩坤，姜子德，向梅梅，等. 中国真菌志（第三十四卷拟茎点霉属）[M]. 北京：科学出版社，2007.
（责任编辑：张艳妮）