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【摘要】 目的：探讨HSP70基因rs2075799基因多态性与冠心病共病抑郁的关联。方法：收集107例冠心病患者临床资料，采用汉密尔顿抑郁量表（HAMD-17）对患者进行筛查，收集到32例冠心病共病抑郁患者和75例冠心病未共病抑郁的患者，抽取外周静脉血，提取DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）方法，对HSP70基因rs2075799的单核苷酸多态性进行检测。结果：冠心病共病抑郁组患者HSP70基因rs2075799位点基因型分布频率和等位基因频率與冠心病未共病抑郁组患者比较，差异均无统计学意义（ 字2=1.10，P=0.16； 字2=2.24，P=0.29）。结论：未发现HSP70基因rs2075799多态性与冠心病患者共病抑郁的易感性之间的关联。
【关键词】 HSP70； 冠心病； 抑郁； 共病； 多态性
Correlation Analysis of HSP70 Gene Polymorphism and Depressive Disorder in Patients with Coronary Artery Disease/PENG Min，YU Shun-ying，QIU Xiao-yan，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（09）：029-032
【Abstract】 Objective：To investigate whether polymorphisms of HSP70 exerts any influence on depressive disorder in coronary artery disease（CAD）.Method：Collect The clinical data of 107 patients with coronary heart disease，used Hamilton Depression Scale （HAMD-17） screening for patients with HAMD-17 were collected，32 CAD patients with depressive disorder and 75 CAD patients without depressive disorder，venous blood was extracted from peripheral DNA，used restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction （PCR-RFLP） method for detection of single nucleotide polymorphism of HSP70 gene of rs2075799.Result：Comparison of coronary heart disease comorbidity in patients with HSP70 depression gene rs2075799 genotype distribution and allele frequencies in patients with coronary artery disease without comorbid depression patients，the differences were no statistically significant（ 字2=1.10，P=0.16； 字2=2.24，P=0.29）.Conclusion：No significant association was found between rs2075799 single nucleotide polymorphisms and the comorbidity of CAD with depression.
【Key words】 HSP70； Coronary artery disease； Depression； Comorbidity； Polymorphism
First-author’s address： The People’s Hospital in Nanshan District of Shenzhen，Shenzhen 518052，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.09.009
冠心病与抑郁症共病率非常高，研究报道，冠心病患者中18%～45%的人患有抑郁症，而抑郁症又会增加冠心病的急性冠脉事件发生率及死亡率，因此深入了解两者共病的病理生理机制，对于两者共病的预防和精准治疗具有重要的意义[1-3]。但两者之间高共病率的原因远未阐明，之前的观点包括抑郁症引发冠心病和冠心病引发抑郁症。后来的观点认为：两者之间可能有着共同的病因或者病理生理发病机制[4]。Mccaffery等[5]的研究发现：冠心病和抑郁症可能有共同的遗传易损性，其研究发现大约20%的抑郁症和冠心病的共同变化可以归因于共同的遗传因素。目前已经较为明确的共同的遗传易感基因是与应激和炎症相关的基因，例如糖皮质激素受体基因多态性、5-HT转运体基因的启动子序列（5-HTT LPR）多态性、BDNF基因多态性[6-7]。
热休克蛋白（heat shock protein，HSP）基因是一个与应激相关的重要的编码基因，位于6号染色体短臂MHC-Ⅲ区，其所编码的蛋白质又称为应激蛋白或者热休克蛋白，热休克蛋白是细胞存活通路上重要的一员。在遭遇高温、缺氧、自由基、感染及心理应激等多种应激源的时候，正常状态下以无活性的单体形式存在于胞浆中的HSF1被激活，转变成三聚体，移位至胞核，结合至HSP基因5’端启动子区的热休克元件（heat shock element，HSE）上而启动HSP基因的诱导表达。HSP70是其中被认为功能最重要的，其最重要的功能在于帮助细胞适应各种可预测和不可预测的系列应激反应，例如在不同应激源下，包括心理应激，可以诱导HSP70在心肌和脑组织大量表达，对心肌细胞以及神经元可塑性发挥的保护作用[8-9]。其机制涉及到修复受损的蛋白质，帮助受损的蛋白质正确折叠，增加Bcl-2表达，稳定和保护线粒体功能，对抗谷氨酸兴奋性毒性，调节钙离子和钙调蛋白，阻断Caspase 3活化，从而抑制级联反应的发生，抑制凋亡，稳定细胞结构等。
尽管HSP70基因是在进化上高度保守的基因，但是研究发现其基因也有突变，这就意味着HSP70突变可能在机体遭遇反复应激下，影响和改变机体的应激反应，使机体对应激的耐受性减弱和对疾病的易感性增加，形成基因与环境的交互作用，从而影响疾病的发生发展。目前已经有很多研究发现HSP70基因多态性与多种心身疾病和精神疾病的疾病易感性有关，包括糖尿病、脑卒中、原发性高血压、冠心病、抑郁症、双向情感障碍、精神分裂症[10-16]。冠心病和抑郁症是两个均与应激密切相關的疾病。上述这些研究提示：HSP70基因多态性既与冠心病易感性，又与抑郁症易感性有关。然而，HSP70基因突变是否改变通过改变机体应激反应，同时参与冠心病和抑郁症的发生发展，成为冠心病共病抑郁的共同易感因素，参与其共同的病理生理机制，目前国内外尚未见相关报道。本研究拟选取HSP70基因上rs2075799位点，检测冠心病患者外周血HSP70基因上rs2075799基因型多态性，探索其与冠心病共病抑郁之间的关系，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2014年7月-2016年10月本院住院冠心病患者为研究对象，病例纳入标准：冠心病定义为冠脉造影时左主干、前降支、回旋支、右冠脉或其主要分支的血管直径狭窄≥50%。排除标准：（1）合并严重肝、肾功能不全或其他脏器严重功能不全者；（2）合并肿瘤或免疫系统疾病者；合并脑血管意外及其他神经系统疾病者；（3）合并急、慢性感染性疾病、高热等者；（4）有严重认知功能障碍及检查不合作者；（5）既往有其他精神疾病个人史或家族史者。采用《精神障碍诊断与统计手册》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，DSM-5）诊断标准入组冠心病合并抑郁患者，采用汉密尔顿抑郁量表（Hamilton depression scale，HAMD-17）评定抑郁严重程度，总分≥24分为严重抑郁；17分≤总分<24分为中度抑郁；7分≤总分<17分为轻度抑郁；总分≤7分为无抑郁症状。总分≥17分患者为冠心病合并抑郁组，总分≤7分为冠心病组未合并抑郁组。经筛选后，共入组107例，男71例，女36例，其中冠心病共病抑郁组（共病组）32例，冠心病未共病抑郁组（非共病组）75例。两组患者的年龄、吸烟史、饮酒史、空腹血糖、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。本研究样本收集及研究方案已通过广东医科大学附属深圳六院伦理委员会审查和批准，所有患者知情同意，并签署知情同意书后方纳入试验。
1.2 方法
1.2.1 采血 清晨空腹采集静脉血5 mL，用于DNA提取，DNA提取和基因多态性检测均在上海市精神卫生中心，遗传学重点实验室完成。
1.2.2 DNA提取 使用莱枫1 mL血液基因组DNA提取试剂盒（莱枫生物科技有限公司）的常规方法提取血液基因组DNA，通过紫外分光光度计（NanoDrop 2000，Thermofisher）测定DNA的浓度及光密度（optical density，OD）OD值。
1.2.3 PCR扩增 引物由Invitrogen公司合成，序列如下：rs2075799-F：AGAGTTGTGTGCAGACCTGT，rs2075799-R：CTGGGTGCTGGAGGGATTC。反应体系为15 μL，其中DNA（原液）2 μL，dNTP Mixture（2.5 mM）0.3 μL，10*PCR Buffer（Takara）1.5 μL，Taq HS（Takara）（5 U/μL）0.1 μL，引物（0.4 μL+0.4 μL）（10 μmoL），以灭菌水补足到15 μL。PCR扩增反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 40 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共40个循环；72 ℃
8 min。电泳后，使用凝胶成像分析系统（Bio-Rad）分析扩增结果。
1.2.4 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法测定HSP70基因rs2075799基因型多态性 10 μL PCR产物与10 U PvuⅡ（NEB）（10 U/μL）酶切过夜后，将PCR产物于凝胶电泳，采用凝胶成像系统对电泳结果进行观察拍照和结果分析，与分子量标准物比较各片段的大小。
1.3 统计学处理 采用拟合优度卡方计算各组各位点基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 基因型的判定和测序验证 PCR产物以及酶切产物见图1、2。
2.2 两组Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验 共病组与非共病组rs2075799位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg的平衡法则，吻合度检验良好（P>0.05）。
2.3 两组基因型及等位基因频率分布的比较 共病组中突变基因型AA和等位基因A的频率均高于未共病组，但差异均无统计学意义（ 字2=1.10，P=0.16； 字2=2.24，P=0.29），见表2、3。
3 讨论
研究报道，冠心病和抑郁症在全球疾病负担分别排行第一和第三，Roth等[17]和Hughes等[18]的研究均认为，到2025年或2060年，冠心病和抑郁症依然位列全球疾病负担的3个主要病因。两者共病更加重冠心病和抑郁的病情，预后更加恶化，更加加重疾病负担[19]。尤其在中国，随着我国人口老龄化情况的日益严重，冠心病和抑郁症发病率将日益增加，疾病负担也将更加繁重。深入探究了解冠心病共病抑郁症的生物学因素，寻找其共同的致病易感因素，以及基因环境交互作用，有利于早期预防以及指导治疗，达到精准医疗的目的。
既往已經有大量的研究发现，HSP70基因与冠心病的易感性有关，例如：HSP70的+190G/C的CC型携带者冠心病风险高于GG型携带者[13，20-22]。有研究发现，血清HSP70高，冠心病风险低[23]。而且另外的研究发现，HSP70基因突变可能通过影响HSP70的表达，与一些精神疾病的易感性有关，如笔者之前的研究也发现，HSP70在慢性应激中对小鼠焦虑样行为具有保护作用[9，24]。Pae等[25]的研究发现，HSP70基因上rs2075799位点G等位基因与抗抑郁治疗反应差有关，提示HSP70基因rs2075799多态性可能参与抑郁的病理生理或抗抑郁药生理机制有关。但是HSP70基因rs2075799基因型多态性是否与冠心病共病抑郁有关尚不清楚。
本研究HSP70基因rs2075799基因多态性与冠心病伴抑郁情绪障碍之间关系，结果显示：HSP70基因rs2075799基因突变型A等位基因频率在冠心病共病抑郁的患者和冠心病未共病抑郁的患者中分别是25.0%和18.7%，显示突变等位基因在冠心病共病抑郁的患者中增加，但差异均无统计学意义（ 字2=1.10，P=0.16； 字2=2.24，P=0.29）。因此本研究不能证实HSP70基因rs2075799的A等位基因型与冠心病患者共病抑郁的遗传易感有关。分析结果，一方面本研究的样本量尚小，只是对这一问题进行了初步的探讨，在后续的验证研究中需要扩大样本量对这一结果进一步验证。另一方面，抑郁症等疾病往往多个基因参与了其致病过程，一个基因位点的突变贡献部分的作用，因此下一步需要对HSP70其他的基因位点和多态性位点进行分析，并对基因位点所编码的蛋白质表达水平进行分析，深入探索其机制。另外通过患者进行跟踪随访，对其治疗效果与基因型的关系进行分析，可以更加进一步深入探索HSP70基因与冠心病共病抑郁及其治疗和预后之间的关系及其机制。
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