摘 要 以石蝉草根、茎、叶为材料，采用Illumina MiSeq高通量测序技术研究石蝉草内生细菌多样性。结果表明，根、茎、叶样品共测得167个OTUs，归属于11个门，分别为变形菌门、Ignavibacteriae、芽单胞菌门、梭杆菌门、厚壁菌门、异常球菌-栖热菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门，各样品的菌群组成和多样性虽有差异，但以變形菌门为优势菌群，约占62.48%～93.24%。在各样品菌群丰度最高的10个OTUs中，叶部优势群落芽孢杆菌属、根部特有群落粘球菌目与石蝉草中具有抗炎、抗肿瘤活性的物质存在潜在相关性。
关键词 石蝉草；内生细菌；高通量测序；多样性
中图分类号 S567 文献标识码 A
Abstract In this study， the species and diversity of endophytic bacteria in the root， stem and leaf of Peperomia dindygulensis Miq. were comprehensively investigated by highthroughput sequencing technology based on Illumina Miseq platform. The results showed that the number of OTUs were 167 in total which belonged to 11 phyla respectively as Proteobacteria， Ignavibacteriae， Gemmatimonadetes， Fusobacteria， Firmicutes， Deinococcus-Thermus， Chloroflexi， Bacteroidetes， Actinobacteria and Acidobacteria. There were differences in the community composition and diversity of endophytic bacteria from different samples， but the dominant groups of 3 samples were Proteobacteria， accounting for 62.48%-93.24%. In this research， it is showed that Bacillus and Myxococcus on genus level were specifically located in the leaf and root， respectively. These may have some correlation with preferable anti-inflammation and anti-tumor effects.
Key words Peperomia dindygulensis Miq.； endophytic bacteria； high-throughput sequencing； diversity
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.017
石蝉草（Peperomia dindygulensis Miq.）系胡椒科草胡椒属植物，多分布于中国南方各省区。《中华本草》、《云南中草药选》等对其均有记载，其味辛、性凉，具有清热解毒、化瘀散结、利水消肿的功效，对肺癌、肝癌、胃癌等有治疗作用[1]。
植物内生菌是指定殖于健康植物组织内部，而又不引发宿主植物表现出明显感染症状的一类微生物[2]。在与宿主植物协同共生的过程中，植物内生菌可产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，包括萜类、芳香类等化合物，这些物质具有多种生物学活性，如抗菌、降糖等[3]。已有研究表明中药材中部分活性成分的形成与其内生菌有关，Strobel等[4]分离于红豆杉韧皮部的内生真菌紫杉霉（Taxomyces aeanae）可以产生紫杉醇或其他紫杉烷类化合物，该类物质对多种恶性肿瘤具有突出疗效；崔晋龙等[5]利用3株活性真菌开展了野外诱导白木香产生沉香的试验，试验证明此方法可应用于沉香的实际生产；陶金华等[6]研究茅苍术内生真菌时发现，内生真菌诱导子能有效提高茅苍术细胞悬浮培养体系中苍术素的产量。
目前，国内外对石蝉草的研究多集中于化学成分的分离鉴定及其生物活性[1，7]，而忽视了植物内生菌在中药材形成中所发挥的作用。陈立[1]研究发现石蝉草抗癌活性成分主要集中在氯仿和乙酸乙酯部位，单体化合物以断联木脂素活性较好。本试验以石蝉草根、茎、叶为研究对象，采用16S rRNA扩增子高通量测序技术对石蝉草的内生菌菌群多样性结构进行分析，旨在探究石蝉草内生细菌种类多样性，为更好地保护和开发利用石蝉草资源提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
2015年10月上旬于云南省文山州马关县采集生长健壮的石蝉草全株，不同部位样品从植株分离后立即装入无菌采样袋中，低温保鲜，于48 h内进行内生细菌的分离，取石蝉草根、茎、叶为分析样品，样品名依次为ROOT、STEM和LEAF。
1.2 方法
1.2.1 表面消毒 取石蝉草根、茎、叶样品，用自来水洗净，75%酒精震荡浸泡1 min，转入2%次氯酸钠震荡5 min，无菌水漂洗5次。取最后1次漂洗水涂布于NA平板作为对照，以此检验表面消毒是否彻底。
1.2.2 DNA提取、PCR扩增和测序 石蝉草根、茎、叶样品总DNA提取参照陈泽斌等[8]的方法。因植物质体对细菌16S rRNA基因的扩增具有极大的污染，本研究采用多重PCR方法对植物来源污染进行抑制，两轮PCR体系不变，仅变换引物并更改相应退火温度。在PCR扩增过程中使用2对引物分别进行两轮PCR，第一轮PCR为抑制植物质体污染，所用引物为P63F（5"-GTCGAACGGGAAG TGGT-3"）和P1490R（5"-CTTCACTCCAGTCGCAA GC-3"），退火温度为68 ℃；随后取第一轮PCR线性扩增产物进入第二轮16S rDNA基因V4区的扩增，其扩增引物为515F（5"-GTTTCGGTGCCAGC MGCCGCGGTAA-3"）和806R（5"-AGTTCCGGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3"），退火温度为54 ℃。16S扩增子PCR体系为10×PCR Buffer for KOD-PlusNeo，5 μL；2 mmol/L dNTPs 5 μL；25 mmol/L MgSO4 3 μL；引物10 μmol/L，各1.5 μL；KOD-Plus-Neo DNA聚合酶，1 μL；ddH2O，32 μL；模板DNA，1 μL。PCR扩增体系为预变性94 ℃，2 min，1个循环；变性98 ℃，10 s，退火，30 s，延伸68 ℃，30 s，26个循环；延伸72 ℃，5 min，1个循环；25 ℃恒温。16S rRNA基因V4区扩增子PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶凝胶电泳分离后切胶纯化回收，回收产物送成都罗宁生物科技有限公司进行16S rDNA基因扩增子高通量测序。高通量测序文库使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit试剂盒构建350 bp小片段文库，随后使用Qubit 2.0进行浓度定量后使用Illumina公司MiSeq Reagent Kit v3试剂盒在Illumina Miseq测序仪上完成高通量测序。
1.3 数据处理
1.3.1 测序数据处理 根据窦妍等[9]的方法，使用FLASH[10]将Miseq测序得到的PE reads进行拼接，同时对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列等操作过程后完成数据过滤，以产生可供后续分析的高质量目标序列。
1.3.2 多樣性和群落结构分析 在97%的相似性水平上使用UPARSE算法[11]进行OTU操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTUs）聚类。挑选出OTU的代表性序列，使用Greengene数据库[12]进行物种分类信息的划分，去除注释为叶绿体、线粒体以及非细菌界或古菌界的OTU。利用 QIIME[13]软件对样品进行Alpha多样性分析，包括Chao1指数和Shannon指数。运用Mothur和R程序对所得的OTUs数目进行维恩（Venn）分析。
2 结果与分析
2.1 序列处理分析
Miseq测序得到的双端序列数据，根据PE reads之间的重叠关系，将成对的reads采用PEAR序列拼接算法合并为1条序列后，根、茎、叶共测得原始序列104 695/124 427/33 685条，对双末端读长序列的质量进行质控过滤后，得到有效序列89 503/105 597/32 577条，有效序列的长度分布在270～310 bp范围内，平均长度约300 bp（表1）。
2.2 样品丰富度分析
由图1可以看出，随序列数增加，3个样品的稀释曲线变化趋势相似并逐渐趋于平缓，但均未达到饱和；当序列数在0～500范围内时，Chao1指数曲线斜率最大，序列数大于500后斜率逐渐变小；3个样品的Shannon指数值在3左右趋于稳定，并表现为叶>根>茎。3条曲线走势表明，测序数据量合理，能反映出样品中细菌的多样性。
2.3 Alpha多样性分析
在97%相似性水平下，利用Usearch 软件将227 677条有效序列分为168个OTUs，其中根113个，茎116个，叶105个，表明根、茎、叶样品的OUT数目差异不大（表2）。Chao1指数和Shannon指数可分别反映样品中菌群丰富度和多样性情况，从表2看，不同部位菌群种类丰富度表现为根>茎>叶，菌群多样性表现为茎>根>叶，茎相较于根和叶菌群多样性更为丰富。
2.4 菌群结构分析
采用Greengene软件进行数据比对，3个样品的167个OTUs归属于11个门（图2），26个纲，48个目，82个科和104个属，主要分布在变形菌门（Proteobacteria）、Ignavibacteriae、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）。茎样品中的细菌分布于11个门，根和叶样品中的细菌分布于10个门，其中梭杆菌门细菌在根样品中未检测到，Ignavibacteriae细菌在叶样品中未检测到。变形菌门细菌为根、茎和叶样品的优势菌群，分别占总菌群的93.24%、62.48%和67.54%；厚壁菌门细菌为根和叶样品的次优势菌群，分别占总菌群的3.15%和18.70%；异常球菌-栖热菌门细菌为茎样品的次优势菌群，占总菌群的25.53%。由此可见，不同部位内生细菌菌群种类和所占比例虽有差异，但变形菌门均为不同部位共有的优势菌群，所占比例在62.48%～93.24%之间。
为进一步了解不同部位内生细菌的分布和组成情况，选取各样品中菌群丰度最高的10个OTUs（表3）。3个样品中菌群丰度最高的10个OTUs的序列比对结果表明（表3），其主要与变性菌门、厚壁菌门、异常球菌-栖热菌门、绿弯菌门和芽单胞菌门相似。其中，根为伯克氏菌目（Burkholderiales，22.12%）、Dokdonella（21.88%）、嗜糖假单胞菌属（Pelomonas，9.60%）、粘球菌目（Myxococcales，8.22%）、弧菌属（Vibrio，4.03%）、B-变形菌纲 （Betaproteobacteria，3.25%）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae，3.04%）、海单胞菌属 （Marinomonas，2.68%）、硫杆菌属（Thiobacillus，2.27%）、芽孢杆菌属（Bacillus，2.01%）；茎为硫杆菌属（Thiobacillus，30.87%）、Truepera（25.46%）、弧菌属（Vibrio，6.15%）、Sulfurimonas（4.44%）、海单胞菌属（Marinomonas，3.87%）、固氮弧菌属（Azoarcus，3.08%）、芽孢杆菌属（Bacillus，2.98%）、绿弯菌门（Chloroflexi，2.63%）、链球菌属（Streptococcus，1.73%）、弓形杆菌属（Arcobacter，1.35%）；叶为弧菌属（Vibrio，24.64%）、海单胞菌属（Marinomonas，13.15%）、芽孢杆菌属（Bacillus，12.14%）、动球菌科（Planococcaceae，5.27%）、硫杆菌属（Thiobacillus，4.62%）、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas，3.91%）、Roseiflexus（3.61%）、Truepera（2.66%）、芽单胞菌属（Gemmatimonas，2.41%）、弓形杆菌属（Arcobacter，2.06%）。弧菌属（Vibrio）、海单胞菌属（Marinomonas）、硫杆菌属（Thiobacillus）和芽孢杆菌属（Bacillus）在所有样品中均有分布；Truepera和弓形杆菌属（Arcobacter）仅在茎和叶中分布；其他仅在1种样品中分布。伯克氏菌目（Burkholderiales）在样品根中含量最高为22.12%；Truepera在样品茎中含量最高为25.46%；弧菌属（Vibrio）在样品叶中含量最高为24.64%。
2.5 样品间OTUs Venn图分析
在OTU分析中，维恩图用于表示多个组样品的OTU共有和独有的情况。从图3可见，3个样品中有60个相同的OTUs；各样品两两间共有的OTUs个数分别为11、14和21个，其中茎和叶的共有OTUs个数最多；各样品独有的OTUs个数分别为13、21和28个，表现为根>茎>叶。
3 讨论
植物内生菌具有丰富的生物多样性，是微生态的重要组成部分，包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌[14-16]。中草药内生菌的相关报道多以内生真菌为主，而内生细菌鲜见报道。黄雅丽等[17]在研究结香和非结香的白木香内生细菌的群落结构及变化时发现，结香前后白木香内生细菌发生显著的、有规律的变化，因此笔者认为中草药内生细菌资源的开发利用有待挖掘。
随着基因测序技术的不断进步，Illumina MiSeq高通量测序技术已先后应用于环境微生物[18]、肠道微生物[19]等的研究之中，该技术克服了传统分子生物学方法通量低、信息量小等缺陷，从基因水平上对微生物群落结构进行解析。就植物组织而言，叶绿体和线粒体与细菌在系统发育上具有高度的同源性[20]，采用高通量测序技术进行植物内生细菌的研究时，陈泽斌等[21]发现，在植物内生细菌16S rRNA-V4变异区测序时，会出现宿主污染现象，导致部分丰度较低的OTUs被忽略，从而影响内生细菌多样性分析结果的全面性和准确性。本试验为减小宿主污染对试验结果的影响，在16S rRNA基因PCR扩增阶段采用多重PCR方法抑制植物质体污染，使各样品测试结果中叶绿体丰度降低至18.66%～53.38%，其中叶部最高，由此可见质体污染是植物内生菌研究的重要障碍，能够在降低质体和线粒体干扰的情况下无偏差地进行微生物多样性的研究是植物内生菌多样性研究的重点。
从各样品菌群丰度最高的10个OTUs分析看，石蝉草内生细菌存在明显的组织特异性。伯克氏菌目和Dokdonella属细菌为根部优势菌群。硫杆菌属和Truepera属为茎部优势群落。弧菌属、海单胞菌属和芽孢杆菌属为叶部优势群落。其中，芽孢杆菌属在石蝉草根、茎、叶中均有分布，已有研究结果表明多种芽孢杆菌属细菌可通过产生脂肽类抗生素和诱导植物系统抗性对植物病原菌产生广谱抗性[22]，同时芽孢杆菌属也是产生医用抗生素的3个主要来源之一[23]；粘球菌目仅存在于石蝉草根部，其广泛分布于全球各地的土壤中[24]，粘细菌为第三大类次级代谢产物产生菌[25]，研究发现粘细菌能产生丰富的生物活性物质，其抑瘤谱较广[26]，抗肿瘤活性甚至高于紫杉醇[27]，是发掘药用活性物质和新型化合物的良好材料[28]。由此推断，石蝉草部分内生细菌可能与其具有抗炎[29]、抗肿瘤[1]生物活性的化合物存在潜在的相关性。石蝉草活性成分的形成是否与其内生细菌的活动具有密切关系，下一步还需通过分离培养等研究进行验证。
4 结论
本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术，从石蝉草根、茎、叶3个样品中共获得167个OTUs，归属于11个门，26个纲，48个目，82个科和104个属，主要门类为变形菌门、Ignavibacteriae、芽单胞菌门、梭杆菌门、厚壁菌门、异常球菌-栖热菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门，各样品的菌群组成和丰度虽有差异，但变形菌门为优势菌群，约占62.48%～93.24%。本研究更加准确、全面的揭示了石蝉草内生细菌群落结构等重要信息，并利用非培养方法首次发现石蝉草内生细菌与其具有抗炎、抗肿瘤生物活性的化合物具有潜在的相关性，从而为深入了解内生细菌与石蝉草之间的相互作用，甚至进一步研究石蝉草内生菌代谢途径及其活性成分形成机理提供了有价值的研究成果。
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