[摘要]目的：以重组腺病毒（Ad）为载体，将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染至小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）中，为MSCs体内示踪提供实验基础。方法：用全骨髓细胞贴壁法分离纯化小鼠MSCs并体外扩增、鉴定，以重组绿色荧光蛋白基因的腺病毒（Ad-EGFP）转染，并用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染率，CCK-8法检测转染细胞的增殖活性。结果：转染后10h MSCs开始表达荧光，6～8天达高峰，转染率可达92.3％，28天仍有表达；转染细胞的增殖活性和未转染细胞无统计学差异。结论：Ad-EGFP能高效、安全的转染mMSCs。
[关键词]骨髓间充质干细胞；增强型绿色荧光蛋白；重组腺病毒；基因转染
[中图分类号]R394.2[文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）02-0257-04
Study on the transfection of enhanced green fluorescent protein gene into murine marrow mesenchymal stem cells
NING Chang,HU Kai-xun,YU Chang-lin
(Department of Heamatologe,Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Science,Beijing 100071,China)
Abstract:ObjectiveTo found the experimental basis of MSCs tracer in vivo,with enhanced green fluorescent protein gene (EGFP)mediated by recombinant adenovirus(Ad) vector transfected murine bone marrow mesenchymal stem cells(mMSCs).MethodsThe mMSCs were separated and eiched by using bone marrow adherent culture and identificated in vitro, to observe the efficiency of transfection of Ad-EGFP by fluorescence microscope and flow cytometry, CCK-8 applied to assay cell proliferation activity.Results10h after transfection MSCs began to express fluorescent, 6 to 8 days reached the peak infection rate of 92.3%, 28 days still expression.Proliferation of transfected cells and untransfected cells no significant difference. Conclusion Ad-EGFP can transfect mMSCs effectively and safly.
Key words:bone marrow mesenchymal stem cells;enhanced green fluorescent protein gene; recombinant adenovirus;gene transfection
骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymcal stem cells，BMSCs）是骨髓基质细胞，因具有较强的增殖及多向分化潜能[1]，成为细胞移植的理想种子细胞，又因其免疫原性低，在多种疾病的治疗中起着重要的作用，在美容医学方面有一定的应用前景。但其在体内的迁徙、定植、增殖过程尚不十分明了，因此有效的分子标记对其体内外示踪有重要的意义。增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）是一种新型的报告基因，具有荧光稳定、无毒、使用方便等特性，可对活细胞实时定位观察。本实验以腺病毒为载体，介导EGFP转染小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs），现将实验结果报道如下。
1材料和方法
1.1 材料：LG-DMEM培养基（Gibco公司），DMEM培养基（Hyclone公司），胎牛血清FBS（Hyclone公司），1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（Sigma公司），FITC标记兔抗鼠CD34、CD45、CD105、CD44（BD公司），0.25%胰蛋白酶（Sigma公司），Cell Count Kit-8（CCK-8）试剂盒（Dojindo公司），X90-3洁净工作台（北京半导体设备厂），37℃、5%CO2恒温细胞培养箱（Therma Forma公司），25cm2、75cm2细胞培养瓶（Coring公司），6孔板、96孔板（Costar公司），常温台式离心机（Heraeus sepatech公司），倒置显微镜（Olympus公司），倒置荧光显微镜及照相系统（Nikon公司），FACS Calibur流式细胞仪（BD公司），ELX800酶标仪（BioTek公司）,Ad-EGFP由本实验组前期构建。
动物：雄性C57BL/6小鼠，5～7周龄，体重19～21g，购于解放军军事医学科学院动物中心（动物合格证号：SCXK-(军)2007-004）。实验动物在军事医学科学院动物中心二级清洁动物房饲养。
1.2 方法
1.2.1 MSCs的分离和培养：用颈椎脱臼引颈法处死小鼠，75%乙醇中浸泡5min，在超净台内无菌分离小鼠的股骨和胫骨，用LG-DMEM冲出骨髓腔内的骨髓，经过200目细胞筛过滤，制成单细胞悬液，1 300rpm/5min离心，去除上清，用PBS重悬细胞，计数，以1.5×106/cm2的密度接种于完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM培养基）,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，48h及72h各换液一次，弃去旧培养液，更换为新鲜的完全培养基，去掉非贴壁细胞，以后每3天更换一次培养液，待细胞接近90%融合时弃去培养液，以0.25%胰蛋白酶常温下消化并传代，用新鲜培养基重悬细胞，按照1﹕2接种于新的培养瓶中继续培养。
1.2.2 MSCs的细胞表型鉴定：取第2代MSCs，用0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞表面CD34、CD45、CD105、CD44的表达。
1.2.3 MSCs的转化实验：取第2代MSCs，分别用成骨诱导体系（DMEM、10%胎牛血清、β-甘油磷酸10 mmol/L、维生素C 50μmol/L、地塞米松 0.25μmol/L）[2]及成脂诱导体系（DMEM、10%胎牛血清、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤0.5mmol/L、吲哚美辛 50μmol/L、地塞米松 0.1μmol/L）[2-3]诱导。成骨诱导时细胞接种密度为5×103/cm2，诱导3周后以Von Kossa染色；成脂诱导时细胞接种密度为1×104/cm2,诱导2周用油红O染色。
1.2.4 EGFP转染MSCs：取第2代MSCs，以1×106细胞密度接种于6孔板中，分别加入感染复数（MOI）为50、150、300的Ad-EGFP在完全培养基中孵育48h，其后更换新鲜的完全培养基继续培养，在荧光显微镜下观察转染细胞的生长及荧光表达情况，待荧光稳定表达后，以流式细胞仪检测转染率。
1.2.5 转染后细胞增殖能力检测：取最佳感染复数Ad-EGFP转染的MSCs，以1×107/ml浓度接种于96孔板中，每孔100μl，同时取第2代MSCs，以相同浓度及体积接种于96孔板中，每天相同时间每组各取5孔细胞，加入10μl CCK-8孵育4h，用酶标仪检测490nm吸光度值（OD值），连续7天绘制细胞生长曲线。
1.2.6 统计学处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS13.0统计软件处理，采用配对t检验。
2结果
2.1 MSCs的分离和培养：在倒置显微镜下观察，接种24h后细胞开始贴壁，多为小圆形及多角形，培养至第7天多数细胞伸展呈梭形并呈集落式生长，在11天左右可融合达瓶底80%～90%。传代培养至第2代时细胞形态趋于统一，呈现为长梭形细胞束装排列（图1）。
2.2 MSCs的细胞表型鉴定：用流式细胞仪检测第2代MSCs细胞表型，MSCs高表达CD105(69.01%)、CD44(95.65%)，低表达CD34(0.76%)、CD45(23.37%)（图2）。
2.3 MSCs的转化实验结果：成骨诱导3周后以Von Kossa染色，可见染色阳性的骨结节；成脂诱导后2周可见油红O染色的红色脂肪细胞（图3）。
2.4 EGFP转染MSCs：转染后10h可见有绿色荧光表达，随时间推移逐渐增强，第7天后表达率达最高并趋于稳定，体外培养28天仍可见荧光。转染率随感染复数的增加而增加，但MOI为300时镜下观察，细胞形态变化较明显，表现为细胞变形、漂浮，提示细胞受损。MOI为150时，转染率较高，且细胞形态变化不大。经流式细胞仪检测三组转染率分别为65.7%、92.3%、94.6%（图4）。
2.5 转染细胞增殖能力检测结果：MOI为150转染的MSCs与未转染的MSCs的OD值差异无统计学意义（P﹥0.05）。两组生长曲线见图5。
3讨论
3.1 BMSCs是骨髓中的非造血干细胞，它来源于中胚层，由于具有横向或跨胚层向多种组织细胞分化的能力，同时易于分离获取、体外扩增，并具备低免疫原性、易于外源基因转染和表达等优点，近年来已成为组织工程、基因治疗及细胞移植等领域中的研究热点。又由于现在我国美容医学的快速发展，使得拥有上述优势的MSCs在美容整形方面有了巨大的运用前景。由于小鼠和人类基因的同源性高，因此对mMSCs的研究是人体研究的基础。
3.2 目前，対BMSCs的分离方法主要有4种：全骨髓细胞贴壁分离法、密度梯度离心分离法、免疫磁珠分选法和流式细胞仪分选法[4]，后两种方法虽可获得较高纯度MSCs，但对实验条件要求较高，在分离过程中対细胞活性影响较大[5]；而密度梯度离心分离法虽简单易行，所得MSCs纯度较高，但对骨髓需要量较大，对于小鼠而言，工作量明显加大，不易获取足够量的MSCs。有文献报道将几种分离方法配合使用[6-8]，因存在费时、耗力、增加实验的成本、时间和实验难度，故未予采用。本实验单纯采用贴壁分离法，起初分离的细胞中包括红细胞、白细胞、MSCs、巨噬细胞和单核细胞，它们的贴壁能力各不相同，由于红细胞、白细胞为悬浮生长，多次换液后基本可清除，而MSCs、巨噬细胞和单核细胞虽然均为贴壁生长，但三者在培养板上的粘附性不同，采用胰酶消化传代时，粘附性较弱的MSCs易被洗脱，而后两种细胞粘附性强，不易被洗脱，因此随旧培养瓶被弃去。因此通过换液和消化传代的方式去除杂细胞，可获得较纯的MSCs，培养时使用10%Hyclone顶级胎牛血清完全培养基，保证了细胞的良好生长。本实验方法不仅操作简单、对实验条件要求低，所获MSCs也达到实验要求，可用于mMSCs的分离和培养。
3.3 由于MSCs缺乏特异性标记，因此鉴定主要是从形态、细胞表型及多向分化能力三个方面着手，本实验中培养细胞由小圆形逐渐长成形态均一、排列有序的梭形细胞；低表达CD34、CD45，高表达CD105、CD44以及有成骨、成脂转化能力，与文献报导一致[2,9]，表明所获细胞是骨髓间充质干细胞。
3.4 细胞移植的研究中，体内外示踪是一个重要环节。目前常用的示踪剂有GFP、Brdu、DAPI等[10-11]，其中GFP由于对细胞无毒、不影响细胞的生长和功能、产生荧光不需添加底物、生色基团的形成无种属特异性等优势，已被广泛应用作原核细胞和真核细胞的标记蛋白。而EGFP是在GFP基因的基础上，替换了影响荧光表达效率的碱基后翻译的产物，因此其荧光强度较GFP显著提高，可高达35倍[12]，更易于荧光显微镜和流式细胞仪分析。本实验采用EGFP标记MSCs，转染后10h即可见荧光表达，第7天表达至最高峰，并可稳定表达28天。而且荧光强度高，无论是在荧光显微镜下观察，还是使用流式细胞仪分析，均能获得理想效果，证实EGFP可用于mMSCs的体内外示踪。
3.5 目前常用的绿色荧光蛋白标记干细胞的方式有3种：质粒载体转染、病毒载体转染和绿色荧光蛋白转基因动物。质粒载体转染由于稳定性较差、转染率低等不足，使用受到限制。绿色荧光蛋白转基因动物由于实验周期长、成本过高，也不易推广。而腺病毒转染效率高、表达稳定、其DNA不整合到宿主基因组、转染后不改变MSC的表型及多向分化潜能[13]，应用较广泛[14-16]，本实验中使用Ad-EGFP转染mMSCs, 效果好、操作简便，在MOI为150时转染效率达92.3%，且转染后细胞病理提示受损细胞少，细胞增殖能力未受影响，与其他两种标记方式相比，试验周期短、操作简便、成本较低，表明是安全、可靠、高效的方法。为进一步研究MSCs在体内的组织修复等研究提供了实验基础。
[参考文献]
[1]Meirelles Lda S,Nardi NB.Methodology,biology and clinical applications of mesenchymal stem cells[J].Front Biosci,2009,14:4281-4298.
[2]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143-147.
[3]项鹏,张丽蓉,陈振光,等.成人骨髓间充质干细胞定向诱导为脂肪细胞的研究[J].中国病理生理杂志，2001,17(7）：598-601.
[4]邱丽燕，王金福.骨髓间充质干细胞的研究进展[J].生物工程学报,2003,19:136-140.
[5]Deryugina EI, Muller-sieburg CE. Sromal cells in longterm cultures:keys to the elucidation of hematopoietic development[J].Crit Rev Immunl,1993,13:115.
[6]张为西,陈松林,姚晓黎,等.小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养与多向分化潜能的鉴定[J].中山大学学报,2008,29:633-636.
[7]陈鹏,谭晓华,马晶莹,等.5和5/F35型腺病毒载体対人骨髓间充质干细胞转染效率的比较[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13:3713-3718.
[8]马粉娜,林国生,曾彬.腺病毒介导hH021基因体外转染骨髓间充质干细胞[J].心脏杂志,2009,21:174-178.
[9]Phinney DG,Kopen G,Isaacson RL,et al.Plastic adherent stromal cells from the bine marrow of commonly used strains of inbred mice:variations in yield,growth,and differentiation[J].J Cell Bioch,1999,72(4):570-585.
[10]Coyne TM,Marcus AJ,Woodbury D,et al.Marrow stromal cells transplanted to the adult brain are rejected by an inflammatory response and transfer donor labels to host neurons and glia[J].Stem Cells,2006,24(11):2483-2492.
[11]Leiker M,Suzuki G,Iyer VS,et al.Assessment of a nuclear affinity labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells[J].Cell Transplant,2008,17(8):911-922.
[12]Cormack BP,Valdivia RH,Falkow S.FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)[J].Gene,1996,173:33-38.
[13]单志新,林秋雄,李晓红,等.腺病毒表达载体対骨髓间充质干细胞分化能力的影响[J].南方医科大学学报,2008,28(7):1673-4254.
[14]张蕾,王家宁,郭凌勋,等.携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒的构建及其在人血管平滑肌细胞中的表达[J].郧阳医学院学报,2009,28(3):214-217.
[15]李志勇,刘磊,田卫东,等.绿色荧光蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究[J].中华口腔医学杂志,2005,40:150-153.
[16]华平,陈炬,张惠忠,等.腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞[J].中山大学学报,2007,28(1):1-5.
[收稿日期]2010-09-28 [修回日期]2011-01-08
编辑/张惠娟