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摘要：烟草青枯病菌是土传病原细菌，其致病力易受多种因素影响。采用穿刺法接种离体叶片，系统性地研究了温度、湿度、接菌量和pH对烟草青枯病菌致病力的影响。试验范围内青枯病菌可致病的病原菌数量为1.3M.3×108 cfu，1.3×108cfu病斑面积最大；致病的温度范围为20～35℃，最适为30-35℃，病害潜伏期随着温度升高而变短；40%-100%的相对湿度范围内均可发病：致病pH范围为5.0～8.0，最适发病pH为6.0。影响青枯病菌致病力的关键因子为温度和pH，湿度不是青枯病发生的关键因素，结果为研究烟草青枯病发生机制提供了科学依据。
关键词：青枯病菌；致病力；温度；湿度；pH
中图分类号：S435.72 文章编号：1007-51 19（2017）05-0008-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-51 19.2017.05.002
长期以来，烟叶生产受到烟草土传细菌性病害烟草青枯病（tobacco bacterial wilt）的危害，其病原菌为茄科雷尔氏菌[Ralstonia solanacearum（smim 1896，Yabuuchi et al.1996 emend）]。该病害是典型的维管束病害，烟草根、茎、叶各部位均可被侵染，但主要危害植物的根和茎，病株侧根常变黑腐烂，茎部可见黑色条斑。该病于1864年在印度尼西亚首次发现，此后，迅速扩展至主要产烟国家并成为制约烟草生产的重要病害，目前在我国主要产烟省区均有发生。近年来，由于气候、土壤酸碱度等方面的原因，该病害在我国的危害范围逐步扩大。
烟草青枯病的发生是烟草、病原菌、环境共同作用的结果，烟草青枯病的发生与病原菌的致病力密切相关。致病力是病原菌侵入寄主后引起致病的能力。影响致病力的因素包括温度、湿度、病原菌的浓度、pH等多个方面，同时病原菌菌株间的致病力也存在差异。引起我国烟草青枯病的茄科雷尔氏菌主要为1号小种3号生化型（R1Bv3）。已有的研究表明，30℃的环境温度和81.42%以上的相对湿度比较有利于烟草青枯病的发生[引，同时温度也会影响烟草品种对青枯病的抗性；接菌浓度1010～1010cfu/mL时均会引起番茄青枯病的发生。目前，烟草青枯病菌可致病的温度、湿度、病原菌浓度及pH范围仍不清楚。本文以一株烟草青枯病菌致病力菌株为研究对象，对其可致病的温度、湿度、病原菌数量及pH范围进行测定，旨在明确影响烟草青枯病致病力的关键环境因子，为烟草青枯病发生机制提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株与烟株
试验于2017年2-5月在贵州省烟草科学研究院微生物实验室开展，烟草青枯病菌（Ralstonia solanaceaFtlm）由该实验室分离鉴定所得。烟草品种为云烟87（Mcotiana tabacum cvYunyan 87）。
1.1.2供试培养基与试剂 烟草青枯病菌的培养使用牛肉膏蛋白胨培养基（NA、NB）、青枯菌专性培养基（SMSA）和（BUG+B）培养基，BUG琼脂由Biolog公司提供，冻干脱纤维羊血（B）由北京友康基业生物科技有限公司提供。青枯病菌不同pH下生长采用的代谢板PM9、接种液IF-OaGN/GP（#72268）和IF-10b GN/GP（#72266）、染料MixA（#74221），均购自美国Biolog公司。
1.2接种量对烟草青枯病菌致病力的影响
将青枯病菌于NB培养液中30℃、170 r/min黑暗培养，48h后吸取5mL菌液，从中吸取0.5mL，用无菌水将菌液依次稀释至100-10-8。采用1 mL无菌注射器从100-10-8的梯度稀释液中分别吸取0.1 mL菌液，采用“穿刺接菌法”将菌液注射至8叶期烟草离体叶片，每点注射15μL菌液，以注射同体积的NB培养基为对照，每个处理重复4次。接菌后将叶片置于30℃、RH 80%、16h黑暗和8h光照交替的环境下培养，72 h后测量病斑的直径并计算病斑面积。此外，从100～10-8的梯度稀释液中分别吸取0.1 mL菌液，分别将其均匀涂布于制备好的SMSA平板上，每处理重复3次，将接菌后的平板置于30℃黑暗条件下培养，72 h后计数平板上长出的菌落数。
1.3温度对烟草青枯病菌致病力的影响
将青枯病菌于NB培养液中30℃、170 r/min黑暗培养，48 h后吸取1 mL菌液，用无菌水将菌液稀释，制备107cfu/mL的菌液。采用“穿刺接菌法”将菌液注射至8叶期烟草离体叶片，每点注射15μL菌液，以注射同体积的NB培养基为对照，每个处理重复4次。接菌后将叶片置于RH 80%、16 h黑暗和8 h光照交替、及不同温度（18、20、25、28、30、35℃）的环境下培养，分别于接菌后24、36、60、84、108和132 h觀察叶片发病情况，测量病斑的直径并计算病斑面积。
1.4湿度对烟草青枯病菌致病力的影响
参照上述方法制备青枯病菌107cfu/mL的菌液。采用“穿刺接菌法”将菌液注射至8叶期烟草离体叶片，每点注射15μL，以注射同体积的NB培养基为对照，每个处理重复4次。接菌后将叶片置于30℃、16h黑暗和8h光照交替、及不同相对湿度（40%、60%、80%、100%）的环境下培养，分别于接菌后72 h观察叶片发病情况，测量病斑的直径并计算病斑面积。
1.5pH对烟草青枯病菌致病力的影响
将烟草青枯病菌在BUG+B平板上纯化培养2代，参照Biolog革兰氏阴性细菌代谢的操作规程进行烟草青枯病菌的不同pH环境下的生长培养，30℃培养5 d后取出培养菌液。用1 mL无菌注射器从pH 3.5～10的菌液中分别吸取0.1 mL菌液，采用“穿刺接菌法”将菌液注射至8叶期烟草离体叶片，每点注射15μL菌液，以注射同体积的无菌水为对照，每处理重复4次。接菌后将叶片置于30℃、RH 80%、16 h黑暗和8 h光照交替的环境下培养，72 h后观察叶片发病情况，测量病斑的直径并计算病斑面积。此外，吸取0.1 mLpH 3.5-10范围内的青枯菌培养液，将菌液用无菌水进行梯度稀释，吸取0.1 mL稀释液均匀涂布于制备好的SMSA平板上，每处理重复3次，将接菌后的平板置于30℃黑暗条件下培养，72h后计数平板上长出的菌落数。
2结果
2.1接菌量对烟草青枯病菌致病力的影响
如表1所示，在烤烟云烟87的离体叶片上，烟草青枯病菌在1.3-1.3×108 cfu的接菌范围内均可使烟草叶片致病，接菌量1 3×102cfu48 h时，发病面积可达0.63 cm2，接菌量不影响病斑扩展面积。
2.2温度对烟草青枯病菌致病力的影响
结果如表2所示，烟草离体叶片接菌15μL的107 cfu/mL的菌液，在18-35℃的温度范围内，除18℃外，烟草青枯病菌均具有致病力；20℃时，青枯病菌接菌84 h后才开始使离体叶片发病；25-30℃处理，接菌36 h后叶片开始发病；35℃处理24 h后叶片就开始发病。在24-132 h的培养时间内，各温度处理下的烟草叶片发病面积均会随着培养时间的延长而逐渐扩大。此外，在20-35℃的测试温度范围内，36-132 h各时离体叶片的发病面积均随着温度的升高而增大。
2.3湿度对烟草青枯病菌致病力的影响
测定结果表明，相对湿度40%、60%、80%和100%的条件下，烟草离体叶片穿刺接种15μL的107 cfu/mL的菌液，青枯病菌均可使叶片发病，其平均病斑面积分别为0.87、1.04、0.87和0.95 cm2。
2.4pH对烟草青枯病菌致病力的影响
结果如表3所示，在pH 3.5-10.0的测试范围内，烟草青枯病菌可生长的oH范围为5.0-9.0，最适为6.0，pH 3.5-4.5和9.5-10.0的环境下青枯病菌均不能存活。在相同的接菌体积下，pH 6.0处理的菌落数量可达1 4×1010 cfu，其次为pH 5.0、7.0、5.5和8.0的处理，pH 8.5和9.0处理的菌落数最小（1.7×103 cfu）。不同pH下的致病力测定结果（表3）表明，烟草青枯病菌可致病的pH范围为5.0-8.0，该范围内的离体叶片发病面积均随叶片培养时间的延长而逐渐增大；pH 8.5和pH 9.0的处理，青枯病菌虽能存活，但离体烟草叶片培养120 h内均未发病。
3讨论
烟草青枯病菌是世界性的土传病原细菌，寄主广，变异强，难以防治。本文以中抗品种云烟87为材料，采用单因子试验，开展了温度、湿度、接菌量和pH对烟草青枯病菌致病力影响的系统性研.究，获得了烟草青枯病菌致病的病原菌数量范围为1 3M.3×108 cfu，致病的温度范围为20-35℃，致病的湿度范围为40%100%，致病的pH范围为5.0-8.0。
溫度是重要的环境因素，对植物病原菌的生长和病害的发生均具有较大的影响。据报道番茄青枯病菌在液体培养基中最适生长温度为30℃，青枯病菌侵染番茄的最低温度为22℃，且温度越高病害发生的潜伏期越短；30℃最有利于辣椒青枯病的发生；大部分青枯病菌菌株在20℃以下没有致病力，但青枯病菌3号小种2号生化型（R3Bv2）被报道18℃时在土豆和番茄上可以致病；烟草青枯病菌的可生长温度范围为15-43℃，28.52℃为病原菌在平板上的最适生长温度，同时30℃左右为烟草青枯病发展的最有利温度；30℃和35℃时不同青枯病抗性的烟草品种均会被青枯病菌侵染。本文采用的离体叶片穿刺接种的方法虽然与上述研究不同，但获得的烟草青枯病菌致病力温度范围同上述报道基本一致。
烟草青枯病菌是土传细菌性病害，土壤pH环境影响着它的定殖和侵染。据报道一些烟草青枯病菌菌株可以存活的pH范围为5.0-9.5，青枯雷尔氏菌在偏酸和偏碱条件下生长较好。本文所测得的青枯病菌可存活的pH范围为5.0-9.5，研究结果与之前报道一致。MICHEL等报道了不同类型土壤中不同pH的土壤处理措施对青枯病病情指数影响，仅在土壤环境中评价了青枯病菌的病情指数与pH的关系。pH对青枯病菌致病力影响方面未见报道，本文首次系统性地评价了pH对青枯病菌致病力的影响。青枯病菌虽然在pH 8.5-9.0的范围内能够存活，但并不能致病，该结论为通过改良土壤pH来防控青枯病提供了科学依据。
本文发现湿度和青枯病菌的数量为烟草青枯病发生的非必要因素。烟草青枯病菌的环境适应能力较强，可供其生长的营养物质范围广泛，在无氮的情况下仍然能够生长。只要温度合适，该病原菌就能迅速繁殖，在寄主存在的条件下，就能侵染烟草进而造成危害。湿度虽不是其致病力的关键因子，但对病害的流行与传播起到积极作用。